阿利吉仑对大鼠心肌梗死后左室重构的影响及作用机制

阿利吉仑对大鼠心肌梗死后左室重构的影响及作用机制

急性心脏病的早期重建是心脏的重建。在梗死区域的早期，原型形成有助于维持心脏的形状，暂时改善心脏的功能，但沉积物的过度增生会导致心力衰竭的重建，从而影响收缩和收缩器官。目前研究认为,影响心室重构的原因主要是内源性神经系统包括肾素-血管紧张肽-醛甾酮系统(Renin-angiotensin-aldosteronesystem,RAAS)、交感神经系统等的过度激活。另外,基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)等细胞因子在心室重构的发生发展中也起到了重要作用1大鼠心肌组织中hs-crp的表达1.1试药培哚普利,法国施维雅(天津)制药有限公司,批号:2000290,规格:每片4mg;阿利吉仑,NovartisInternationalAG,批号:0078-0486-15,规格:每片300mg。1.2实验动物60只8周龄清洁级雄性Wistar大鼠,合格证号:SCXK(鲁)20090001,体质量250~280g,均购自山东大学动物中心,许可证号:SYXK(鲁)20130001,并分笼饲养。所有大鼠均置于标准条件下,室温18~24℃,相对湿度45%~65%,符合国家制定的《试验动物管理条例》各项标准,以标准大鼠饲料喂养,各组大鼠饮食及饮水充足。1.3心肌梗死实验动物模型建立所有动物随机分为假手术组,模型对照组,培哚普利组和阿利吉仑组。大鼠麻醉后连接Ⅱ导联心电图以观察大鼠心电图的动态变化。结扎冠状动脉左前降支近端。当心电图Ⅱ导联ST段呈明显弓背向上抬高,而且左心室局部心室前壁颜色变暗,认为结扎成功。其中假手术组则只将缝线绕过冠状动脉,但不予冠状动脉结扎。模型对照组、培哚普利组和阿利吉仑组3组大鼠均行心肌梗死模型建立手术。术后第2天,培哚普利组和阿利吉仑组分别给予培哚普利(2.5mg·kg1.4MMP-2、MMP-9、TIMP-1、转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)免疫组织化学染色及图像分析大鼠处死后取心肌组织,MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β常规免疫组织化学染色后应用ImageProPlus6.0多媒体彩色病理图像分析软件系统,选择放大指数×10,×20,×40,对所有标本摄影,免疫组化染色组织中棕黄色为阳性表达。并对染色阳性物质进行分析测定,每张切片随机选取视野10个(×40),测其阳性面积百分比,取平均值,进行统计分析。1.5MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-βmRNA和蛋白的表达荧光定量聚合酶链反应(realtimepolymerasechainreaction,RT-PCR)检测心肌组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β、CollagenⅠ和ⅢmRNA的表达。根据Genebank序列,同时参考相关文献,由上海博亚生物技术有限公司合成用设计β-actin、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β、CollagenI和Ⅲ的引物。组织蛋白提取后,采用SDS电泳分析MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β蛋白的表达。1.6酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmuno-sorbentassay,ELISA)检测血清中hs-CRP的表达hs-CRPELISA试剂盒,购自美国RD公司;双抗体夹心ELISA法检测试剂盒,购自美国R&D生物科技公司。酶标仪上检测,并绘制标准曲线,计算浓度值。1.7统计学方法采用SPSS13.0版统计学软件进行统计分析,结果用均数±标准差(ue0af±s)表示,各组之间的比较采用完全随机设计的单因素方差分析,当3组均数差异有统计学意义时,采用两两比较q检验方法。多次重复测量数据时应用重复测量数据的方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。2各组大鼠心肌相关基因表达情况2.1免疫组化染色观察分析共有52只大鼠存活,其中假手术组15只,模型对照组和培哚普利组均为12只,阿利吉仑组13只。免疫组化分析发现假手术组着色弱且分布较局限,模型对照组阳性面积着色分布广泛,且呈强阳性,定量分析较假手术组差异有统计学意义(P<0.05)。培哚普利组和阿利吉仑组较假手术组的表达增加,较模型对照组表达明显减少(P<0.05),而培哚普利组和阿利吉仑组相比差异无统计学意义(P>0.05)。模型对照组、培哚普利组和阿利吉仑组TIMP-1明显少于假手术组(P<0.05),培哚普利组和阿利吉仑组较模型对照组增多(P<0.05)。而培哚普利组和阿利吉仑组相比并无明显差异。见图1~4,表1。2.2RT-PCR检测各目的基因mRNA的表达MMP-2mRNA表达:与假手术组比较,行心肌梗死手术后的模型对照组、培哚普利组和阿利吉仑组大鼠心肌组织MMP-2、MMP-9、mRNA、TGF-β、CollagenⅠ、CollagenⅢ表达都明显升高(P<0.05),TIMP-1mRNA表达水平降低(P<0.05)。但与模型对照组相比,培哚普利组和阿利吉仑组心肌组织的MMP-2、MMP-9、mRNA、TGF-β、CollagenⅠ、CollagenⅢ表达明显降低(P<0.05),TIMP-1mRNA表达水平升高,而培哚普利组和阿利吉仑组心肌组织的mRNA的表达则差异无统计学意义(P>0.05),见表2。2.3Westernblot检测蛋白的表达与假手术组比较,心肌梗死后模型对照组、培哚普利组和阿利吉仑组大鼠的心肌组织MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白的表达都明显升高(P<0.05),TIMP-1蛋白水平降低。但与模型对照组比较,培哚普利组和阿利吉仑组心肌组织的MMP-2、MMP-9、TGF-β表达明显降低(P<0.05),TIMP-1蛋白的表达明显升高(P<0.05)。而培哚普利组和阿利吉仑组心肌组织的表达则差异无统计学意义,见表3。2.4ELISA检测血清中hs-CRP的表达与假手术组比较,心肌梗死手术后的模型对照组、培哚普利组和阿利吉仑组三组大鼠血清中hs-CRP的表达都明显升高(P<0.05)。但与模型对照组比较,培哚普利组和阿利吉仑组血清中hs-CRP的浓度明显降低(P<0.05),而培哚普利组和阿利吉仑组血清中hs-CRP的水平则差异无统计学意义(P>0.05),见图5。3阿利吉仑对左室重构的作用心肌细胞外基质成分的合成和降解代谢平衡失调是引起心肌重构的主要因素之一。MMP通过影响细胞外基质的降解而在心力衰竭心肌重构的发生发展中起重要作用心肌间质的主要成分是胶原蛋白,主要有5种类型,即Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ及Ⅵ型胶原,Ⅰ型胶原最多,约占85%以上,Ⅲ型约占11%,Ⅳ、Ⅴ及Ⅵ型胶原含量极少。心肌胶原网络主要由Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成,Ⅰ型胶原是粗条索状聚合纤维,弹性小,张力强,僵硬度大;Ⅲ型胶原是细网状聚合纤维,弹性大,张力小,与室壁弹性有关。心肌胶原网络结构主要功能为心肌细胞提供支持框架,维持心室的几何形态,决定心室顺应性。间质胶原正常情况下处于合成与降解动态平衡。在某些病理状态下,如心肌梗死、高血压、心肌炎、心肌病等,胶原合成和降解平衡失调,胶原逐渐累积,Ⅰ型和Ⅲ型胶原比例失调(即胶原重构),引起室壁硬度增加,顺应性降低,心室收缩与舒张功能受损,最终导致心力衰竭在本研究中,大鼠心肌梗死后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因和蛋白水平较假手术组明显升高,证实胶原代谢的紊乱。而应用阿利吉仑后,发现明显降低了Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达,改善胶原的代谢,从而证实肾素抑制药在预防心室重构中的作用,保证心脏结构和功能的完整和协调性。MMPs是一组锌离子(ZnMMPs的表达和活性以及MMPs/TIMPs的适当比例对于维持心肌内胶原合成和降解代谢的动态平衡具有重要的意义。MMPs表达及活性的过度激活或者MMPs/TIMPs比例的失衡是导致心室重构和心肌纤维化的直接原因。既往研究发现心力衰竭患者的MMP-2明显升高,TIMP-4则相应降低,胶原代谢活跃,但是给予相关的抗心力衰竭药物治疗后,随着MMP-2的相应下降及TIMP-4的升高,心肌纤维化的程度减轻,心功能也得到改善近年来对阿利吉仑取得一系列的研究发现,但是其对心室重构中的作用及其具体机制仍不清楚。本研究以大鼠建立心肌梗死模型,证实阿利吉仑可以明显改善左室重构。而且与培哚普利比较,对左室重构的影响没有明显的差异。TGF-β是心肌细胞分化的重要抑制因子,当心肌负荷的增加可促进TGF-β的表达增加。本研究中急性心肌梗死术后8周,发现模型对照组TGF-βmRNA和蛋白的表达明显高于假手术组,提示发生心室