感受态细胞制备的实验方案探讨

感受态细胞制备的实验方案探讨

感染细胞的制备是获得高质量基因库的关键。由于诱导细菌进入感受态的机制尚不完全清楚,且感受态细胞的转化率受诸多因素的影响,实验室之间差异较大。尤其在室温较高时,感受态制备的效果很不稳定,摸索高温季节制备高效感受态细胞的方法仍十分必要。此外,高效感受态细胞贮存不当会很快丧失其感受性,如何较好地贮存感受态细胞亦是一个亟待解决的问题。本文首次系统研究了诱导大肠杆菌DH5α进入感受态的条件,并对感受态细胞的保存条件进行了优化,初步建立了适合南方高温季节制备高转化率大肠杆菌感受态细胞的有效方法。1.1材料1.1.1菌株与质粒:1.1.2主要试剂:①TSS转化缓冲液:10%PEG,5%DMSO,20mmol/LMgCl1.1.3培养基:LB培养基、SOB培养基参照文献1.1.4实验仪器:数显振荡培养箱(BS-IE),Allegra21RCentrifuge(Germany),小容量恒温摇床(HWY-100A),Refrigerant-80℃(HarrisManufacturingCo.),Refrigerant-20℃(Electrolux),8453型紫外分光光度计(惠普公司,德国,测OD值用),光密度仪(Bio-Rad,GS-710),电泳仪(ES250-90),紫外分析仪,紫外分光光度计(Amershambiosciences,测核酸浓度用)。1.2方法1.2.1标准质粒制备:常规碱裂解法抽提质粒,琼脂糖凝胶电泳检测,紫外分析仪下观察,将显示为超螺旋DNA带型的凝胶切下,胶回收后电泳确保质粒全部为超螺旋状态,紫外分光光度计测其纯度及浓度,TE稀释为1ng/μL,存于-20℃备用。1.2.2大肠杆菌18℃下生长状态的测定:取-80℃保存的DH5α菌株划线接种于SOB板,37℃过夜培养12～16h后挑取单菌落(直径2～3mm)接种于25mLSOB液体培养基,同时设对照组,即挑同一菌落于含Amp的SOB培养液中,37℃,250～300r/min振荡培养6～8h;将上述初始培养物以1∶100的比例接种于盛有50mLSOB培养液的锥形瓶中,18℃200r/min摇菌;在接种1h后每隔1h取样测菌液的OD1.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备(1)TSS法:当菌液OD值为0.3时,菌液冰浴10min;4000r/min离心10min收集菌体;以5mL预冷的TSS转化缓冲液充分重悬菌体;迅速将悬液分装到预冷的1.5mLEp管中,贮于-80℃冰箱备用。(2)超高效法(3)CaCl1.2.4转化及转化率测定:参照文献1.2.5贮存方法:新鲜制备的感受态细胞,分批加入终浓度7%DMSO、10%甘油,分装后,分别于-80℃和-20℃冰箱贮存,每周检测转化率1次。22.1肠杆菌生长状态的确定为更好地控制集菌时间及探讨感受态细胞转化率与大肠杆菌生长状态的关系特绘制此生长曲线(图1)。该生长曲线主要包括了大肠杆菌在18℃培养条件下群体生长周期中的迟缓期、对数期及稳定期初期。2.2加标回复突变实验感受态细胞的效果比较用3种方法制备的每批感受态细胞均取出3管进行转化,取其平均值代表该批感受态细胞的转化率。该实验重复9次,各取平均值为该种方法制备的感受态细胞的转化率(表1)。经方差分析可知,三种制备方法得到的感受态细胞的转化率差异极显著(F>F2.3感受态细胞转化率感受态细胞转化率的影响选取OD值0.2～1.1分别进行感受态细胞制备,发现感受态细胞的转化率与OD值显著相关(图2)。其中,在OD值为0.36、0.58时获得了最高转化率,达到1.1×102.4各长度内最大描述如图所示,-80℃保存效果明显优于-20℃保存,二者至少相差1个数量级(见图3-6);DMSO的保存效果优于甘油,用DMSO作为冷冻保护剂贮存于-80℃超低温冰箱的感受态细胞在40多天后仍能保持1.68×103dmso与甘油的比较三种方法制备的感受态细胞以超高效法转化率最高。可能是因为18℃培养使细菌合成的菌膜成分和物理性状更有利于攫取DNA,从18℃生长曲线可知,低温也有利于高效转化生长时相的延长。柯涛大肠杆菌群体生长周期包括迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。结合所绘制的生长曲线可知:当OD值为0.36、0.58时,细菌正处于其对数期的中期,此时,细菌处于最理想的生长状态。细菌在该期生命力强,对转化缓冲液的反应性强,被诱导处于感受态的细菌较多;同时,细菌耐受冷打击、冷冻保存造成的物理损伤、溶液效应的能力也更强,故获得较高的转化率(1.1×10DMSO的保存效果优于甘油。可能是因为DMSO分子量(78.14)较甘油(92.10)小,能更快地进入细胞膜,与磷脂发生静电反应,提高膜的液态流动性,降低膜脂质的相变温度,从而增加生物膜对渗透压和细胞皱缩的耐受性,保护了冷冻和解冻过程中细胞膜的稳定性。同时,DMSO也可诱导细胞膜上的某些特殊的物质用于其微孔的形成,减少运输阻力,更有利于质粒DNA进入。而甘油进入细胞膜所需时间较长,且毒性较DMSO大,对感受态细胞的转化率也有影响。另外,在本试验中,发现-80℃超低温冰箱的冷冻保存效果优于-20℃