玉米叶片硝酸还原酶活性的研究

玉米叶片硝酸还原酶活性的研究

氮素是玉米生长发育所需物质的主要来源，在玉米产量中起着重要作用。目前报道的测定植物叶片NR活性的方法主要有活体法1材料和方法1.1玉米自交系试验材料取自陕西省杨凌示范区西北农林科技大学西卜村新品种示范园中进行田间试验的玉米自交系许178。于2015年7月20日,在玉米吐丝后一周时取长势均匀一致的植株穗位叶叶片,迅速放入液氮中冷冻,带回实验室放入-80℃冰箱保存,用于NR活性的测定。1.2处理因素和设计参考《植物生理学实验指导》1.2.1研磨nr活性参考文献[15]给出的研磨方法是把植物叶片放在研钵里面,加入少量石英砂和缓冲液后手动研磨。作者在采用此方法测定NR活性的时候发现该方法研磨速度较慢,大批量测定时影响试验效率。因此,为了提高研磨速度,设置了一个液氮研磨的处理,旨在探讨不同研磨方法是否对NR活性测定有所影响。1.2.2不同nadh用量对nr活性的测定无梯度对活性的测定不影响小在标准方法加入0.30mLNADH的基础上,另外设置了0.45、0.15、0.10mL几个梯度,目的在于了解NADH用量对NR活性测定的影响。1.2.3ph对nr活性的影响酶的活性不仅受到温度的影响,还受到其他因素的影响,pH就是其中的1个重要因素,本试验设置了7.0、7.5、8.03个pH梯度,以确定玉米NR还原反应的最适pH。1.2.4反应温度的确定反应温度是最重要的影响因素,本试验设置了20、25、30、35、40℃5个酶活反应温度梯度,目的在于确定玉米NR还原反应的最适温度。1.2.5反应时间对nr活性的影响在标准方法给出的反应时间30min基础上,另外设置了40、20、10、5min的反应时间,目的在于确定缩短反应时间是否会影响玉米NR活性的测定。1.2.6酶活显色时间梯度设计在标准方法给出的显色时间15min基础上,另外设置了5、10、20、25min4个酶活显色时间梯度,目的在于确定最佳的显色时间。1.2.7统计分析方法NR活性测定采用标准曲线法,从标准曲线中检出NO式中,C用MicrosoftExcel2003和SPSS19.0软件进行统计分析。2结果与分析2.1研磨法测nr活性选用了液氮研磨法和石英砂研磨法2种方法,结果如图1所示。尽管采用液氮研磨法速度较快,可以提高试验效率,但是测得的NR活性比石英砂法显著降低。因此,为了保证试验结果的可靠性和准确性,采用石英砂研磨法。2.2原剂nadh量对nr活性的影响不同的样品,其NR活性不同,对于不同的样品质量,NR的活性也是不同的2.3过酸及过碱法pH是影响酶活性的重要因素之一,只有在特定的pH条件下,酶才能够表现出最大的活性。过酸或过碱不仅会降低酶的活性,有时甚至会使酶的活性丧失。由图3可知,pH7.5时NR的活性最大,说明其最适pH为7.5,且与pH为7.0、8.0相比,差异达到显著水平。2.4反应温度对酶活性的影响在一定条件下,每种酶都有其最适反应温度,低于或高于其最适反应温度都会降低酶的活性。同时,对于相同的酶,不同的植物可能其最适反应温度也有不同。《植物生理学实验指导》2.5反应时间及时间对nr活性的影响从图5可以看出,反应时间为20、10min时测得NR的活性与30min时测得的酶活性无显著差异,反应时间为5、40min时测得的NR活性与30min测得的NR活性差异显著。因此为了快速准确地测定酶的活性,10min是较好的反应时间。2.6不同时间点的nr活性由图6可知,5min的显色时间与其他4个时间测定的NR活性差异显著,而其他4个时间点测定的NR活性差异不显著。因此为了节约时间,提高测定效率,可以把显色时间缩短至10min。3讨论3.1最佳研磨法的温度对nr活性的影响本试验结果表明,石英砂研磨法比液氮研磨法对NR活性的测定更为合适,原因可能是液氮的超低温对叶片中的NR活性产生影响。在超低温下,酶的活性可能会彻底丧失,或酶在超低温下活性降低后难以恢复,从而影响酶活性的测定。与液氮研磨法相比,石英砂研磨法的温度适中,酶活性损失较少。因此对于硝酸还原酶活性的测定,石英砂研磨法是较好的选择。3.2不同nadh用量对玉米穗位叶nr活性的影响NADH作为生物体中提供还原力的一种物质,对植物的生命活动影响重大,是必不可少的。在NR的测定过程中,NADH的用量对酶活性的测定也具有影响。因此,本试验针对其用量进行了探讨。本试验结果表明,NADH的用量由0.30mL增加至0.45mL,对结果无影响,减少其用量至0.15mL时,对酶活性的测定影响较小,但当加入量为0.10mL时,测得的酶活性显著降低。原因可能是在一定的提取液中,对酶的提取量是一定的。对于玉米穗位叶NR活性的测定,0.15mL的NADH是足够的,因此增加NADH加入量对酶活性的测定没有显著差异;但当低于0.15mL时,由于还原力不够,酶活性显著降低。因此,为节省成本,可以在不影响试验结果的同时适当减少NADH用量。3.3最适温度为35，最适ph值为7.5试验结果表明,玉米NR活性测定的最适还原温度是35℃,低于或高于这个温度都不能很好地测定NR的活性。同时发现与Averina等3.4不同反应时间对nr活性的影响在酶活性测定过程中,显色时间和反应时间对酶活性的测定也具有一定的影响。显色时间过短,亚硝酸盐与磺胺及萘胺的反应不能充分进行,得出的酶活性偏低;显色时间过长,则浪费了许多时间,试验效率低。同时也发现,反应时间的长短也会对酶活性的测定产生影响,反应时间过短,反应不能充分进行,测得的酶活性低;反应时间过长,也会使测得的酶活性降低。因此在本次试验中,对反应时间和显色时间进行了优化设计。试验中共设了5个显色时间梯度进行研究探讨,结果表明,将显色时间降低到10min对NR活性的测定结果无显著影响;但当显色时间降低到5min时,酶活性显著降低,其原因可能是时间太短,反应还未充分进行,说明亚硝酸盐与磺胺及萘胺的反应可能在5~10min已反应完全,之后反应液的颜色不会发生显著变化,即反应液的吸光度也没有显著变化。因此,为了节省时间,可以将显色时间缩短到10min。同时对反应时间进行了优化,当缩短至20min和10min时对酶活性的测定结果没有影响,与Férrario-Mery等4反应条件的确定分别对硝酸还原酶活性测定过