玉米醇溶蛋白-多糖纳米颗粒的制备及生物活性评价

玉米醇溶蛋白-多糖纳米颗粒的制备及生物活性评价

姜黄素是一种天然的脂肪溶解度多酚，存在于生姜和黄鼠尾根。这是中国传统中药姜黄的主要活性成分。研究表明,姜黄素具有抗氧化、抗感染、抗菌、抗病毒、抗风湿病、神经保护、抑制癌细胞增殖等多种药理活性利用玉米醇溶蛋白制备负载姜黄素的纳米颗粒,以提高姜黄素在水中的分散性及生物活性逐渐受到重视1材料和方法1.1海藻酸钠c玉米醇溶蛋白(医药级,上海抚生实业有限公司);姜黄素(质量分数>98%,AcrosOrganics);果胶(橘皮果胶)、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胆盐、Tween80、维生素C(美国Sigma-Alorich);海藻酸钠(食品级,青岛明月海藻有限公司);1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH,日本TokyoChemicalIndustry);HCl、NaOH、无水乙醇、二甲基亚砜、三氯甲烷等都为分析纯。大肠埃希菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由广东省微生物菌种保藏中心提供;营养琼脂、营养肉汤(广东环凯微生物科技有限公司)。1.2仪器、试药与仪器R05磁力搅拌器(瑞士IKA);pH-3CpH计(上海仪电科学仪器股份有限公司);R-1001N旋蒸蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司);Nano-ZS激光粒度仪(英国Malvern);NovaNanoSEM430场发射扫描电镜(荷兰FEI);TU-1901紫外可见分光光度计(北京谱析通用仪器有限公司)。1.3含姜黄素-醇溶蛋白-果胶纳米颗粒的制备参照文献用注射器将4.0mL姜黄素-醇溶蛋白溶液缓慢分散至16mLpH4.0蒸馏水(0.1mol/LHCl溶液调节)中,分散时以磁力搅拌(1000r/min,3min),旋转蒸发乙醇,并用pH4.0的蒸馏水补充到20mL。将制得的分散液注入到25mL果胶/海藻酸钠多糖溶液中,分散时磁力搅拌(900r/min,5min),得到含姜黄素-醇溶蛋白-果胶/海藻酸钠纳米颗粒分散液,调节至pH4.0,离心(3000r/min,10min)除去大颗粒即为所需的样品。以动态激光散射法测定颗粒的粒径分布。1.4吸光度测定取冷冻干燥后的纳米颗粒10mg,溶于10mLDMSO中,避光,磁力搅拌2h(500r/min),离心(5℃,12000r/min)1h,取上清液以DMSO稀释10倍,在433nm处测定吸光度。同波长下测定不同浓度的姜黄素-DMSO溶液的吸光度,并绘制标准曲线(y=0.15x-0.002,R1.5扫面电镜观察取少量纳米颗粒黏附于导电胶上,喷金(15nm)后在场发射扫面电镜下观察,高真空模式,10kV加速电压,放大倍率×100000。1.6dpph自由基去除试验参考文献式中:A1.7纳米改性抗菌能力的测定将大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌菌株分别接种营养肉汤培养基(pH7.4),稀释至101.8纳米外测量法的测定1.8.1模拟监狱胃蛋白酶模拟消化法准确称取0.1g冷冻干燥的纳米颗粒(姜黄素质量分数9.52%)或与纳米颗粒组分相同的姜黄素、玉米醇溶蛋白和果胶混合物分散在20mL双蒸水中,磁力搅拌器搅拌分散1h(500r/min),然后加入到20mL模拟胃液中(含0.064g胃蛋白酶,质量分数0.2%NaCl,质量分数0.05%Tween80,盐酸调节pH至1.2),将混合液调整到pH2.5,在37℃恒温摇床保温消化2h,然后以NaOH溶液调节pH6.8,终止消化。1.8.2模拟喂食阶段将胃液消化液置于37℃水浴中,依次加入37℃预热的胆盐溶液(质量浓度为4.7%)4.0mL、CaCl1.8.3三氯甲烷层总离子束的制备将最终的消化液离心分离(12000r/min,30min),收集上清液并记录体积。取上清液4.0mL,加入三氯甲烷4.0mL,涡旋混合2min,离心分离,取三氯甲烷层。水层再用三氯甲烷4.0mL提取1次,离心分离后合并三氯甲烷层。在417nm波长下测定吸光度。同波长下测定不同浓度的姜黄素-三氯甲烷溶液吸光度,并绘制标准曲线(y=0.1254x-0.0016,R式中:C1.9统计分析与统计学处理数据均以ue0af±s表示,用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析(ANOVA),用Duncan多重比较进行显著性分析,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果与分析2.1纳米颗粒的粒径激光动态光散射测得的负载姜黄素纳米颗粒的粒径分布见图1A。可见,绝大多数颗粒分布在100~200nm范围,同时也存在少量的粒径小于100nm的颗粒。颗粒的平均粒径为133nm,多分散性指数(PDI)为0.22,说明制备的纳米颗粒粒径均匀。纳米颗粒的微观形貌见图1B。可见,纳米颗粒呈球形,表面光滑,大多数粒径在100~200nm,与动态光散射法测得的数据一致,经测定冷冻干燥后的纳米颗粒的再分散性,结果表明分散的纳米颗粒溶液为澄清透明状,无肉眼可见大颗粒,使用动态光散射测得的纳米颗粒的平均粒径较新鲜制备的纳米胶体溶液的平均粒径稍大。冷冻干燥后的纳米颗粒产率为(87.86±2.77)%,包封率为(92.9±4.8)%,载药量为(6.2±0.23)%。2.2dpph清除能力变化姜黄素具有较强的清除DPPH自由基能力,但在水中溶解度极低,将姜黄素溶解在乙醇溶液中,能发挥其清除自由基能力。从图2可见,姜黄素乙醇溶液、姜黄素纳米颗粒和维生素C对DPPH·的清除能力呈现剂量依赖型增长,而无姜黄素的纳米颗粒清除自由基的能力极低,且无剂量依存关系。维生素C的自由基清除活性最强,在质量浓度为10μg/mL时,自由基清除能力已达到90%。当姜黄素质量浓度高于5μg/mL时,纳米颗粒负载的姜黄素比姜黄素乙醇溶液表现出更强的自由基清除能力,且随着姜黄素质量浓度的增加,近似线性的增加。而乙醇溶解的姜黄素在质量浓度超过20μg/mL时,清除自由基能力随浓度的增加增幅下降。姜黄素乙醇溶液、纳米颗粒和维生素C的SC2.3姜黄素纳米颗粒的抗菌能力平板抑菌圈试验测定纳米颗粒负载的姜黄素对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌革兰阴性菌(G2.4纳米颗粒或混合物中姜黄素的吸收利用以模拟胃肠消化液体外消化负载姜黄素的纳米颗粒及与纳米颗粒组分完全相同的姜黄素-玉米醇溶蛋白-果胶的混合物,评价模拟消化后消化液溶解的姜黄素的量,不能溶解于消化液中的姜黄素被认为不能被人体吸收利用。以消化液中的姜黄素与消化前纳米颗粒或混合物中姜黄素的百分比表示姜黄素的吸收率,结果表明,纳米颗粒包埋的姜黄素消化吸收率为14.8%,而混合物中姜黄素的消化吸收率仅为3.6%(P<0.05)。姜黄素几乎不溶于水,为了增加消化后的姜黄素在水中的溶解度,在模拟胃液消化中添加了质量分数为0.05%的吐温80,以乳化剂的胶束溶解消化后释放的姜黄素。因此,可以认为