克氏原螯虾烂尾病病原的分离鉴定

克氏原螯虾烂尾病病原的分离鉴定

克氏原虾腐败是一种细菌疾病，也经常发生在水产养殖生产中。主要原因是机械损伤、相互殴打和细菌感染，但菌株的类型没有确定。在烂尾病发病早期，患病虾出现尾扇边缘发红、水泡、溃烂、坏死等症状，高温季节严重感染时可引起病虾整个尾部溃烂甚至死亡。克氏原螯虾细菌性疾病的病原菌种类繁多，其相关研究也十分广泛，但关于早春季节克氏原螯虾烂尾病的病原研究鲜有报道。2020年4月，江苏省扬州市某养殖场克氏原螯虾出现烂尾症状，病虾尾扇部位出现肉质肿胀和灼烧状疤痕，病虾正常摄食，除尾扇边缘溃烂外，体表和内脏均无明显病变，经光学显微镜观察和PCR检测排除真菌、寄生虫和病毒病原。为防止该病原继续发展产生更大危害，笔者采集病虾样本并开展相关研究，为克氏原螯虾疾病预防提供理论依据。1材料和方法1.1平均体质量测定患病克氏原螯虾取自江苏省扬州市某养殖场，共计4尾鲜活病虾，平均体质量约20g。健康克氏原螯虾购自扬州市宝应县某养殖场，平均体质量(20±1)g。1.2试剂和动物用药敏分析试剂营养琼脂培养基购于南通凯恒生物科技发展有限公司；营养肉汤培养基购于南京便诊生物技术有限公司；TaKaRaMiniBEST通用基因组DNA提取试剂盒为TaKaRa公司产品；革兰氏染色试剂盒购于Solarbio公司；动物用药敏分析试剂板购于南京菲恩医疗科技有限公司；PCR相关试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司，PCR引物也由该公司合成。1.3形态分离菌株的筛选取活体病虾4尾，用无菌接种针蘸取尾部病灶组织于营养琼脂平板上划线，28℃培养箱培养24h,取优势菌落于营养琼脂平板上多次分离纯化，得到2株代表菌株。同时将单菌落接种于营养肉汤培养基中，在28℃恒温振荡培养箱中增菌24h,保存备用。1.4菌株分离菌将健康克氏原螯虾分成2个试验组，分别感染2株分离菌。每个试验组分设5个小组，包括3个感染组和2个对照组，每组设3个平行，每个平行投放8尾虾。3个感染组分别加入1×101.5细菌的鉴定1.5.1细菌形态特征观察观察培养基平板上菌落形态，并对纯化培养的病原菌进行革兰氏染色，置于1000倍光学显微镜下观察细菌形态特征。同时测定病原菌蔗糖、半乳糖、尿素、精氨酸、赖氨酸等生理生化指标。1.5.2细菌通用引物序列取纯化培养的新鲜菌液，按照试剂盒操作说明分别提取2种细菌的DNA,用细菌通用引物序列F:5′-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3′和R:5′-GACGGGCGGTGTGTACAA-3′1.5.3gyrb基因系统发育树构建将分离菌的gyrB基因序列提交BLAST检索系统比对，选择相似度较高的菌株基因序列，使用MEGA7软件邻接法构建gyrB基因系统发育树(自展1000次)。1.6细菌相关特征的分析1.6.1引物序列的分析DNA提取方法相同，定居因子CFA基因引物序列为F:5′-TCCAGCGCATTCA-3′和R:5′-TCCAGCCTTCGGCAAACG-3′1.6.2ccagcgcgctctacrt-3模型DNA提取方法相同，几丁质酶chi基因引物序列为F:5′-CCAGGCGCCGTGGARRTCRTANSWCA-3′和R:5′-CGTGGACATCGACTGGGARTWYCC-3′1.6.3药物敏感性分析试验使用药敏分析试剂板，对恩诺沙星、硫酸新霉素和甲砜霉素等8种常见抗菌药进行药物敏感性分析，筛选有效抗菌药物。参照微量二倍稀释法测定药物最低抑菌质量浓度，药敏试验结果判定参照文献[13]。2结果2.1细菌的分离自患病克氏原螯虾病灶部位(图1a)分离出2株具有不同形状和色泽的代表菌株，分别编号为LW2047-1和LW2047-2。2.2人工感染试验2.2.1高密度感染组人工感染后饲养10d,菌株LW2047-1的感染组和对照组均无烂尾症状，高密度感染组出现少量死亡，死亡个体无烂尾症状。菌株LW2047-2各密度感染组均出现烂尾症状，平均发病率分别为70.8%、54.2%和45.8%,对照组1的平均发病率为25%,对照组2未出现烂尾症状(表1)。2.2.2肝胰腺组织病理学检测在饲养过程中，菌株LW2047-2感染组病虾症状与采集的病虾样症状相似，病虾可以正常摄食，早期尾扇剪切部位出现溃烂和肉质囊肿，后期结痂形成灼烧状疤痕(图1b～d)。在未剪切尾扇的对照组1中同样有小部分虾产生尾部溃烂症状，症状相对较轻(图1e)。在高密度组中有多尾虾严重感染后死亡，在死亡虾尾扇、肝胰腺、鳃和肌肉等组织中均能分离出该种细菌，死亡个体肝胰腺颜色正常，但有蜕壳未遂症状(图1f)。感染试验结束后，从感染组病虾尾部再次分离到与菌株LW2047-2特征相同的菌株。试验结果表明，克氏原螯虾烂尾病病原为菌株LW2047-2。2.3细菌的鉴定2.3.1油亮紫外光光谱分离菌株LW2047-2的菌落为圆形，乳白色，边缘薄，直径为1～2mm,油亮反光(图2a)。该菌为革兰氏阴性菌，短杆状，两边钝圆，分散排列，偶尔出现菌体黏结成长条状，以单个菌体或多个菌体聚集成团居多(图2b)。2.3.2生理生化特征生化鉴定结果显示，菌株LW2047-2各项理化指标符合柠檬酸杆菌(2.3.3srrna基因序列分析菌株LW2047-2的16SrRNA基因经测序后，得到长度为495bp的有效序列，将基因序列提交BLAST比对，结果显示，该菌株16SrRNA基因与弗氏柠檬酸杆菌I-M-5-3、CX-100和78B-3相似性最高，达到99.35%,但与柠檬酸杆菌属其他几种菌株的相似性也较高(>98.91%)(表3)。2.3.4gyrb基因系统发育树构建菌株LW2047-2的gyrB基因经测序后，得到长度为1144bp的有效序列。选择嗜水气单胞菌作为外群模式菌，构建gyrB基因系统发育树(图3)。结果显示，菌株LW2047-2与一株弗氏柠檬酸杆菌归为一支。2.4细菌相关特征的分析2.4.1带，阴性对照CFA基因引物扩增出约100bp的清晰条带，阴性对照为无菌水(图4a)。检测结果表明，弗氏柠檬酸杆菌LW2047-2具有定居因子基因CFA,可以表达产生毒力因子黏附素。2.4.2条带及嫌犯的关系chi基因引物扩增出的条带大小约为250bp,引物特异性好，无杂带，条带大小与目的片段一致，阴性对照为无菌水(图4b)。检测结果表明，弗氏柠檬酸杆菌LW2047-2具有几丁质酶基因chi,可以表达产生几丁质酶。2.4.3d-2药物敏感性检测利用药敏分析试剂板测定弗氏柠檬酸杆菌LW2047-2的药物敏感性(表4)。结果表明，该菌株对恩诺沙星和硫酸新霉素高度敏感，对磺胺类药物不敏感，对氟苯尼考和盐酸多西环素中度敏感。3讨论3.1革兰氏阴性发酵杆菌弗氏柠檬酸杆菌属肠杆菌科，菌体呈杆状，半透明或不透明，表面有光泽，边缘不整齐，不产生吲哚，是一种革兰氏阴性、氧化酶阴性的发酵产气杆菌。该菌为条件致病菌，需氧或兼性厌氧，在光学显微镜下多为单个或双个散状排列，电镜下可见其鞭毛，无芽孢和荚膜弗氏柠檬酸杆菌的毒力因子主要包括溶血素、内毒素、蛋白水解酶、几丁质酶和黏附素3.2条件致病菌群弗氏柠檬酸杆菌作为人类肠道中的正常菌群，是一种兼性厌氧的条件致病菌。Barnes等弗氏柠檬酸杆菌作为鱼类病原菌最早被报道于1982年，Sato等3.3病原菌的药物敏感性在水产养殖业中，抗菌药物可直接杀灭细菌，达到防病治病的效果，而不同细菌的药物敏感度各不相同。因此，分析病原菌的药物敏感性对疾病防控和养殖生产指导具有重要意义。陈红莲等4虾体表面感染试验结果