六α淀粉酶酶学性质测定II改

六、α-淀粉酶酶学性质测定II

（米氏常数Km值的测定)

1.目的意义

由LeonorMichaelis和MaudMenten在1913年提出的米氏方程（Michaelis-MentenEquation）是酶学中表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的、表示一个酶促反应的起始速度V与底物浓度[S]关系的方程。

米氏方程形式如下所示：其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度,即V=1/2Vmax时,Km=[S]

。在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是一级反应（firstorderreaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixedorderreaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zeroorderreaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为米氏方程的模拟作图：米氏常数的意义由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,即V=1/2Vmax时,Km=[S]。上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L(在本实验中单位为g/L)。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者为酶最佳底物，即天然底物。2.实验原理底物浓度对酶促反应的影响在酶浓度、pH、温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示：在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。

酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burkplot，也可称为双倒数方程(double-reciprocalplot)：

用1/V对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示：Km=-1/x3.仪器设备3.1试剂10mg/ml可溶性淀粉1500ml0.005%碘液2000ml0.25M醋酸溶液0.4MpH6.0醋酸缓冲液3.2器材15ml大试管20支1ml移液管2支5ml移液管2支10ml移液管2支200ml烧杯2个100ml烧杯2个玻棒1支双蒸水1瓶（50ml）比色皿1套（4个）、玻璃皿1套、洗瓶1个吸耳球1个记号笔1支试管架2个200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl-10μl移液器各1支；小号、中号、大号枪头各1盒（需灭菌）旋涡混合器1套（置于每组桌上）4.实验方法取一定量的酶（稀释为10-6倍）；加入各种不同浓度的底物（如表所示）；在一定时间内测定产物的量（30min）；建立x，y轴，作图，建立回归方程；在Y=0时，求其x值（即[S]）→Km；4.1测定—取12支试管，分别标记，按照下表操作。编号123456789底物浓度[S]（mg·mL-1）46810121416182010mg/ml淀粉溶液（ml）0.40.60.81.01.21.41.61.82.0醋酸缓冲液（ml）2.62.42.22.01.81.61.41.21.0预热40℃5minα-淀粉酶（ml）1反应时间30min反应终止各管加入0.25M醋酸10ml显色反应取1ml反应液加入预先加入试管中的0.005%碘液中，振荡混匀A(OD700nm)1/A1/[S](mg·ml-1)

注意：每组（不同底物浓度）都需要设置D0为对照，计算出U值。

chenhuicheng@4.2数据处理各管在700nm测定OD700nm值（注意，比色皿务必洗净擦干）。由于光密度（OD700nm）与显色，显色与底物浓度成正比，反应时间均为30min。计算1/V，以1/V为纵坐标作图。由于测定所用单位为mg·mL-1换算为Km