文档转基因大豆

一、国外转基因大豆新品种培育研发的基本流程以现有大豆品种作为受体材料，利用基因工程手段，构建重组植物表达载体，用农杆菌介导法和基因枪法两种方法将目的基因导入大豆，获得转基因植株，分析其对疫霉根腐病的抗病性，筛选出抗病大豆新株(品)系。由于根癌农杆菌介导的转基因技术体系具有插入基因拷贝数低、遗传稳定、转化过程相对简单、成本相对低廉等诸多优点，一直是植物转基因研究的首选技术，在大豆中亦是如此。自Hinchee等于1988年建立根癌农杆菌介导的大豆子叶节器官发生转化系统之后，许多实验室以此为基础开展了优化、改进工作和转基因材料创制研究，也使该技术体系成为了最为重要的大豆转基因手段。在根癌农杆菌介导的大豆转基因技术体系建立的同时，基因枪介导的大豆转基因技术体系也获得了成功。尽管基因枪介导的转基因技术体系存在多拷贝插入频率高、断裂的DNA片段插入难以避免、转基因后代遗传稳定性较差等缺点，但由于其受基因型限制较小，操作流程相对简单、遗传转化相对较易实现等优点，仍是植物转基因研究的重要手段之一。在大豆遗传转化较为困难的现实条件下，其在大豆中的使用依然较为普遍，特别是在利用转基因大豆材料进行基因功能分析的研究中更为常见。

二、如何有效减少转基因后代材料中目的基因沉默或丢失的现象1、避免基因间的同源性由于重复或同源序列是基因沉默的普遍诱因，因此，在构建表达载体时，尽量降低所设计的序列与内源基因的同源性，以减少或避免配对。应尽量使外源DNA碱基组成与植物DNA碱基组成相一致，以避免被植物限制修饰机制所识别。同时，也可以采用定点插入方法，将外源基因插入到具有与其相似碱基组成的染色体区域。另外，在育种过程中要选择外源基因表达稳定的株系。2、避免重复序列的出现基因枪法以及电激法等直接DNA导入法易引起多个拷贝基因整合，使用根癌农杆菌介导法转化植物可在一定程度上避免这一问题。因此在进行植物转化时，应优先考虑使用后一方法。同时，在筛选作为育种材料的转基因植株时，应尽量选择单拷贝插入的个体，来减少重复序列的存在。3、消除甲基化的影响鉴于转基因甲基化程度与转基因沉默的程度成正相关，即甲基化是基因沉默的直接原因。在载体上加上有去甲基化功能的序列以防止甲基化。如目前已知用5-氮胞嘧啶处理植株具有很好的抑制甲基化和脱甲基化作用。但由于其价格昂贵，兼有致癌性，因此实用价值不高。4、MAR的使用使用核基质结合区（matrixattachmentregion,MAR）序列是克服外源基因沉默的有效方法。MAR是染色质上的一段DNA序列，又称之为核骨架结合区(scaffordattachmentregion)。把MAR构建到外源基因的两侧，使它们在转基因植物的染色质中形成独立的区域，这样不但可以避免外源基因表达位置效应的影响，而且还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平。5、使用诱导型启动子大多数的科研工作都是使用组成型强启动子，不过诱导型的启动子迄今仅在少数植物中获得了转基因植株。如用于双子叶植物转化的花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子。三、目前国内外研发机构主要采用的大豆遗传转化方法及其优缺点目前大豆遗传转化的方法较多，主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、PEG法、显微注射法、电激法、超声波辅助农杆菌转化法等，其中常用的方法有农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法。1、农杆菌介导法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，该细菌能够在自然条件下有趋化性的感染大多数双子叶植物的伤口部位，并能够诱导其产生冠瘿瘤或发状根。农杆菌介导法(Agrobacterium-mediated)中应用的主要有根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发方向。3、安全性评价应用转基因作物具有极大的经济效益的同时，也存在一定的风险，包括对环境、食品的安全性、抗性基因的稳定性及抗性杂草发生影响等。大豆是人类可食用的最重要的植物蛋白质之一。由于转基因大豆安全性存在不可预见性，因此，必须要对其进行长期监控。每一种新研制的转基因大豆都必须通过个案处理，评估其可能存在的风险，以确保进行环境释放和市场释放时转基因作物及其加工的食品具有高度的安全性。六、目前我国转基因大豆研发中存在的关键问题及其解决措施大豆遗传转化技术不断完善，根癌农杆菌介导法和基因枪法快速发展，其转化效率不断提高。但与其他主要作物（如水稻、玉米等）相比差距较大。根癌农杆菌介导法流程相对简单、仪器设备便宜、拷贝数低，且转基因较少沉默，可转移基因片段较长。由于受大豆基因型、组织类型、时龄（Age）、菌液浓度和培养温度等众多因素的影响，其转化效率较低（3%）；需要精细的人工操作，且不定芽源于多细胞，所形成的再生植株有较多的嵌合体，加大了后代的筛选难度；各个实验室间的转化率差距较大，重复性差，应用受到限制。而基因枪法基因沉默和拷贝数多，且其耗资大、技术难，微弹难以完全覆盖靶组织，转化有效性受到限制。近年来，不断有新的方法（如花粉管导入法和晶须介导法）、新的菌种（发根农杆菌）和新的受体材料等出现，但由于方法自身特点，在大豆中的应用尚未普及。在基因克隆、载体构建和转化方面都尽量减少选择基因使用，如花粉