基于色考克氏菌sdb9的生长素合成途径研究

基于色考克氏菌sdb9的生长素合成途径研究

生长素是一种含有饱和芳香族环和醋酸侧链的内源激素，在植物生长发育过程中起着重要作用。生长素作为最重要的植物激素，影响植物细胞的伸长和分裂、植株向地性和向光性的形成、主侧根和下胚轴的生长、维管组织的发育及根毛和花器官的形成，它对植物的早期发育和形态建成均具重要意义植物生长素最早可能参与植物与微生物相互作用，并满足植物自身发育调控的需要目前，研究人员普遍认为植物和微生物体内的IAA有多条合成途径，但每条途径中具体的生物反应机制尚有许多研究空白，不同种类的生物个体所依赖的主要合成途径也有待明确近年来发现的与生长素合成相关的重要催化酶系和克隆的关键调控基因多数属于依赖色氨酸合成途径，非依赖色氨酸途径知之甚少。但标记试验和色氨酸营养缺陷型突变体研究早就预测存在IAA合成的非色氨酸依赖途径王建武等从榆林沙地柏根中分离一株植物根际促生细菌玫瑰色考克氏菌SDB9,该菌体内生长素(IAA)含量高达7748.1ng/g,但其高水平合成生长素的机理尚不明确11.1美吉生物公司测序玫瑰色考克氏菌SDB9基因组数据由上海美吉生物公司进行测序，相关数据保存在美吉生信云平台上(https:///)。1.2方法1.2.1序列的生物信息分析参考王建武等1.2.2对组图的分析利用美吉生信云平台上(https:///)的在线软件进行分析。22.1sdb9的功能对SDB9菌基因组进行全基因组扫描后发现，SDB9菌基因组上存在2个酰胺酶(amidase)基因，该类基因属于IAA合成的IAM通路，存在22个氨基转移酶(aminotransferase)基因，其中gene0621(基因组注释编号)在Swiss-Prot数据库中被注释为芳香族氨基酸氨基转移酶(aromatic-aminoacidaminotransferase),存在4个乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase)基因，该类基因属于IAA合成的IPyA/TAM/TSO通路的最后一步(图1)。有意思的是，在SDB9基因组存在色氨酸操纵子序列，gene2169注释为trpA,色氨酸合成酶α链(tryptophansynthasealphachain),COG分析具有分解磷酸吲哚甘油(indoleglycerolphosphate)变成吲哚(indole)和磷酸甘油醛(glyceraldehyde3-phosphate)的功能，即具有吲哚合成酶(indolesynthase)活性；gene2170注释为trpB,色氨酸合成酶β亚基(tryptophansynthasesubunitbeta),COG分析具有从indole和L-serine合成色氨酸的功能；gene2171和gene2172是推定的蛋白(hypotheticalprotein),COG分析是色氨酸相关的跨膜蛋白(tryptophan-associatedtransmembraneprotein);gene2173注释为trpE,邻氨基苯甲酸合成酶组份I(anthranilatesynthasecomponentI),上述5个基因排列在一起，形成一个操纵子(图2)。基于以上分析推测SDB9存在非色氨酸依赖的IAA合成途径，即从indole直接合成IAA(图1)。色氨酸合成途径比较漫长，消耗大量能量和前体，是细胞内最昂贵的代谢途径之一，其合成一般都会受到严格调控，因此细菌体内一般不会大量合成并积累色氨酸，而SDB9菌能高水平合成IAA,其原因可能是存在非色氨酸依赖的合成途径。在附近区域还存在谷氨酸合成相关基因gltD和gltB,以及组氨酸合成相关基因hisF、hisG和hisE(图2),推测色氨酸操纵子附近的基因簇可能在功能上有联系，属于一个超操纵子。虚线表示参与反应的酶的生化活性尚未确定。加粗表示的酶的基因已被鉴定表征，而灰色字体的酶表示仅被检测到或仅被提出可能存在，相关基因尚未被克隆证实。红色方框示出的酶表示在本研究对象玫瑰色考克氏菌SDB9基因组上存在同源序列。中间代谢物缩略词：Trp,tryptophan;IAOx,indole-3-acetaldoxime;IAN,indole-3-acetonitrile;IAM,indole-3-acetamide;IPyA,indole-3-pyruvate;IAAld,indole-3-acetaldehyde;TAM,tryptamine;IGP,indole-3-glycerolphosphate.相关酶的缩略词：AAT,aminoacidaminotransferases(e.g.patB)图参考Kunkel等2.2玫瑰色考克氏菌sdb9的生物合成途径对推定的生长素合成相关基因，进一步分析发现：trpA/gene2169,trpB/gene2170,trpE/gene2173是保守性较强，功能明确的色氨酸合成相关基因，合成色氨酸的中间代谢物吲哚(indole)也是非色氨酸依赖途径合成IAA的中间代谢物，因此，玫瑰色考克氏菌SDB9通过非色氨酸依赖途径合成IAA的可能性比较大(表1);gatA/gene0610,amiE/gene2951基因的保守性也较强，但通过序列相似性注释功能为通过酰氨基转移修正错误酰化的Gln-tRNA(Gln),且该作用依赖谷氨酰胺(glutamine)和ATP,这种功能跟IAA合成不相关，因此，玫瑰色考克氏菌SDB9可能不通过IAM途径合成IAA(表1);-/gene0621的保守性不强，因此没有推荐的基因名称，22种氨基转移酶中只有这一个注释为芳香族氨基酸氨基转移酶，因此，玫瑰色考克氏菌SDB9有可能通过IPyA途径合成IAA(表1);-/gene0516,putA/gene0524,aldB/gene2488,-/gene3495这4个乙醛脱氢酶序列差异比较大，功能上应该有分化，即都有乙醛脱氢作用，但参与脱氢的具体生化反应不同，IAAld是合成IAA的一个前体，也是最后一步反应(图1),TSO、IPyA和TAM途径都会产生IAAld,乙醛脱氢酶催化IAAld变成IAA,因此，乙醛脱氢酶在玫瑰色考克氏菌SDB9合成生长素过程中可能具有重要作用(表1),上述4个乙醛脱氢酶基因值得进一步深入研究。2.3合成iaa的细胞Pseudomonassyringaepv.tomatostr.DC3000的乙醛脱氢酶(命名为PsALDH,NCBI登录号AAO54270.1)是一个经过实验证实的参与生长素合成的酶(KrALDH4比较特殊，跟节杆菌属Arthrobactersp.U41中乙醛脱氢酶(登录号：CP015732.1)的同源性为80.39%,节杆菌属Arthrobacter的细菌常能合成IAA,是目前细菌合成IAA机理研究比较深入的菌属NCBI登录号：KocuriaroseaSDB9与Kocuriarosea(WP_109221515.1)的氨基酸序列完全一致，Kocuriasp.CNJ-770(WP_075871390.1),Kocuriasediminis(WP_156269351.1),Arthrobactersp.Hz2(WP_120150400.1),Pseudarthrobacterphenanthrenivorans(WP_013599286.1),Pseudarthrobacterpolychromogenes(WP_188813526.1),Arthrobactersp.Br18(WP_026550067.1),Arthrobactergandavensis(WP_152218597.1),Arthrobacterechini(WP_136453888.1),Arthrobactersubterraneus(WP_090587244.1),Arthrobactersp.H20(WP_026553632.1),Arthrobactersp.H5(WP_028278884.1),Corynebacteriumdeserti(WP_053546260.1)2.4ps甲基h3krasb.cofici执法的aldh-sfKrALDH3的相对分子量为56.1KDa,pI为4.75,疏水性分析没有发现明显的疏水区域，利用TMHMM2.0Server也没有预测到跨膜区段(图4),说明KrALDH3是一个可溶性蛋白。KrALDH3氨基酸序列在NCBI网站(http:///Structure/cdd/wrpsb.cgi)上进行Blast比对，结果显示该序列包含完整的依赖NAD(P)+的乙醛脱氢酶超家族(aldehydedehydrogenasesuperfamily,ALDH-SF)保守结构域。依赖NAD(P)+的乙醛脱氢酶通常有3个保守结构域，即NAD(P)+结合域(cofactor-bindingdomain),催化区域(catalyticdomain)和连接区域(bridgingdomain),依赖NAD(P)+的乙醛脱氢酶通常以二聚体或四聚体的形式发挥功能，连接区域是形成多聚体的结合部位，NAD(P)+是供能的，催化区域完成脱氢作用。PsALDH和KrALDH3都具有这3个功能结构域(图5)。NAD(P)+结合域的氨基酸残基由虚下划线标出，催化区域的氨基酸残基用方框标出，连接区域的氨基酸残基用下划线标出，保守构型的氨基酸残基底部由星号标出。33.1底物基因的起源乙醛脱氢酶基因起源于