辽伏苹果类黄酮提取工艺研究

辽伏苹果类黄酮提取工艺研究

类黄酮具有抗菌、抗寒、消炎、抗过敏、血管扩张等功效。1材料和方法1.1材料和机器(1)苹果苗圃培养辽伏苹果,于2009年7月下旬采自国家果树种质兴城苹果圃,冰箱中4℃下保存15天。标准品儿茶素、芦丁,购自中国药品生物制品检定所,其他试剂均为分析纯。(2)仪器和设备TU-1800SPC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),BIOFUGEPRIMO型台式高速离心机(ThermoElectronCorporation),KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),调速多用振荡器(深圳天南海北实业有限公司)。1.2苹果样品制备取10个大小均匀的辽伏苹果果实,清洗后擦干,将苹果去核,切成小片,混匀,平均分成4份,分别用如下方法提取类黄酮:(1)常温振荡法取1份苹果样,用组织捣碎机匀浆1min,称取10.00g,加入80%乙醇30mL,在往复式振荡器上室温(20℃)提取5h,过滤,滤液在5300r/min下离心10min,上清液35℃减压旋转蒸发3h,用甲醇移入棕色玻璃瓶中并定容至10mL,冰箱中-20℃下保存。(2)液氮冷冻研磨法取1份苹果样,称取10.00g,置研钵中,加入液氮,研磨,用80%乙醇30mL移入烧杯中,混匀,放置10min,真空抽滤。滤液减压蒸发、溶解、保存等按(1)操作。(3)匀浆法取1份苹果样,称取10.00g,加入80%乙醇30mL匀浆1min,真空抽滤。滤液减压蒸发、溶解、保存等按(1)操作。(4)超声法取1份苹果样,称取10.00g,加入80%乙醇,室温下避光超声提取3次。每次加10mL80%乙醇,提取时间分别为1h、30min和30min,合并提取液,真空抽滤,滤液减压蒸发、溶解、保存等按(1)操作。1.3黄酮含量的测定参照文献1.4检测波长的确定以试剂空白为参比溶液,分别吸取100μg/mL儿茶素溶液、100μg/mL的芦丁溶液和样液各1mL,按1.3操作,定容至10mL后在波长190～900nm的光谱下进行扫描。1.5显色稳定实验以试剂空白为参比溶液,取1mL样液,按1.3操作,在2h内,每间隔10s测定510nm的吸光度。2结果与分析2.1标准品的确定由图1可知,在整个光谱扫描区间,芦丁和样液显色后吸光度变化趋势一致,而儿茶素和样液吸光度在190～300nm的变化趋势差异比较明显。因此,芦丁作为样液类黄酮检测的标准品比较合理。芦丁和样液显色后在260、320、510nm处均有吸收峰,但260nm和320nm处于紫外区,且峰较尖锐,受干扰因素影响大,因此选择510nm为样品的检测波长。2.2吸光度的下降由图2可以看出,在体系显色的最初22min内,样品或标准液在510nm的吸光度迅速下降;22min后趋于稳定,下降速率仅为每小时5%。因此,测定苹果类黄酮含量时,应在显色22min后尽早测定,标准曲线绘制和样品的测定,从显色到测定之间的时间间隔均应一致。2.34重复性与相对标准偏差4种方法提取的苹果类黄酮含量两两间差异均显著(表1)。超声法最好,类黄酮得率为0.042%,且稳定性良好,重复样之间的相对标准偏差为5.3%。匀浆法次之,类黄酮得率为0.035%,稳定性最好,重复样之间的相对标准偏差仅为2.5%。液氮冷冻研磨法再次之,类黄酮得率为0.023%,且重复样之间的相对标准偏差高达9.0%。常温振荡法最差,类黄酮得率为0.013%,重复样之间的相对标准偏差最高(达13.3%)。3超声法提取类黄酮法对比试验显示,常温振荡法、液氮冷冻研磨法、匀浆法、超声法等4种方法中,超声法是苹果类黄酮提取的较