天然抑菌剂的研究与应用

天然抑菌剂的研究与应用

自6000年前人类开始使用和生产动物以来，各种产品，如挤奶和其他食品也被开发出来。一方面是由于口味的需要,更主要的原因是源于对乳的保存。近代利用化学添加剂和物理处理的方法,使远离奶源的人们能享受到新鲜乳汁。化学防腐剂应用到乳制品中已经很长时间了,但鲜有应用到鲜乳中。近代的生产实践和科学研究,使我们了解到许多天然蛋白质产物对人体无害,却有很强的抑菌功能,特别是对耐热和极耐热芽孢菌的抑制,使经过高温处理的乳制品品质得到更好的保证。1乳酸链球菌素乳酸链球菌素是乳酸链球菌(Streptococcuslactis)产生的细菌素(抗生素),是Rogers在1928年首次发现的,具有杀菌和杀死细菌孢子的特性。乳酸链球菌素能抑制多数革兰氏阳性菌,尤其对产生芽孢的革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等有很强的抑制作用,而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌一般无效。它能有效地抑制引起乳制品腐败的梭状芽孢杆菌、耐热孢子和肉毒杆菌的生长,从而可使传统灭菌强度大大地降低,提高产品的品质。乳酸链球菌素对人和动物无毒无害,在人体肠道内很容易被降解成氨基酸;乳酸链球菌素具有热稳定性,在酸性条件下,甚至可以耐受120℃,15min的灭菌;乳酸链球菌素还具有可溶性和可扩散性。这些特征使乳酸链球菌素在食品工业中开发成抑菌剂。乳酸链球菌素是天然的、安全的,因为它是食品级乳酸菌产生的34个氨基酸组成的活性肽。它通过以下方式杀死细菌:(1)在细菌细胞膜上形成电压依存的孔;(2)防止细菌细胞壁的形成;(3)诱导细菌的自我分解。1962年联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)接受乳酸链球菌素作为食品抑菌剂。到目前为止,已有50多个国家采用了乳酸链球菌素,包括欧盟(foodadditiveE234)和美国。在澳大利亚和新西兰,奶油制品可以添加10mg/kg的乳酸链球菌素,面粉点心中可以添加的最高量是250mg/kg,啤酒、油乳化剂和奶酪等乳制品中使用乳酸链球菌素也取得了非常好的效果。目前,乳酸链球菌素已成功应用于硬质干酪、巴氏杀菌干酪、巴氏杀菌奶、罐装浓缩牛奶、高温灭菌牛奶、高温处理风味奶、酸奶、乳制甜点等制品中。在鲜乳中添加50mg/kgNisin,即可抑制造成鲜乳和乳制品腐败的耐热性细菌,使产品保存期延长2~3倍。研究显示,添加Nisin能使低脂的牛乳、无盐的奶油、无脂肪的牛乳、调味乳保存期延长至6周;添加80~100mg/kgNisin于罐装无糖炼乳中,可抑制耐热性孢子的生长,减少热加工时间10min。在干酪的加工过程中,Nisin是最有效的保护剂。干酪原料经80~100℃巴氏杀菌后,梭状芽孢杆菌孢子仍能存活,干酪中的微生物为丁酸梭菌、酪丁酸梭菌、生孢梭菌,尤其是肉毒梭菌在加工的干酪中产生毒素。研究表明,在巴氏杀菌的干酪中加入500~1000IU/mLNisin能阻止梭状芽孢杆菌的生长和毒素的形成,同时还能降低食盐和磷酸盐的用量。印度用乳酸链球菌素使仅能存放3~7天的巴氏杀菌奶保存了60余天。如果在巴氏杀菌奶中加入30~50mg/L的乳酸链球菌素可以使其在35或50℃环境中延长货架期2倍。使用的方法是将乳酸链球菌素直接(或制成水溶液)加入到产品中,充分混合均匀是使用的关键。另外的问题是,Nisin溶解性和稳定性依赖于溶液的pH值(pH值为2~3),在中性pH值或碱性条件下,Nisin极难溶解,并且即使在室温下也会失活。牛奶的复杂成分也许会保护Nisin免于全部失活,增加Nisin的用量也会达到杀菌的效果。2溶菌酶的性质1928年英国细菌学家弗莱明(AlexanderFleming)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,并将其命名为溶菌酶。该酶能水解细菌的细胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4-糖苷键,故又称胞壁质酶,即N-乙酰胞壁质糖苷聚糖水解酶。现在从鸡蛋清提取溶菌酶以及从霉菌中提取溶菌酶均已达工业化生产水平,并且研究较详细。鸡蛋清中约含有0.3%的溶菌酶,该溶菌酶能分解溶壁小球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八迭球菌等革兰氏阳性菌,但对革兰氏阴性菌无分解作用。当有乙二胺四醋酸存在时,某些革兰氏阴性菌也可以被该溶菌酶分解。鸡蛋清溶菌酶、蛋清溶菌酶是由129个氨基酸残基构成的一种碱性蛋白,分子量为14000,等电点为11.1,最适溶菌温度为50℃,最适pH值为7。鸡蛋清溶菌酶是一种化学性质非常稳定的蛋白质,当pH值在1.2~11.3范围内剧烈变化时,其结构仍保持稳定,遇热时该酶也很稳定,在pH值为4~7的范围内,100℃处理1min,仍能保持原酶活性,但在碱性环境中,该酶对热稳定性较差。鸡蛋清溶菌酶的稳定性主要与多级结构中的4个二硫键、氢键及硫水键有关。人乳中含有大量的溶菌酶,而牛乳中则很少,将溶菌酶添加到牛乳及其制品中,可使牛乳人乳化;研究还表明,溶菌酶是双歧杆菌的增长因子,有防止肠炎和变态反应的作用,对婴幼儿的肠道菌群有平衡作用;在干酪生产中添加溶菌酶可代替硝酸盐抑制丁酸菌的污染,防止干酪产气,并对干酪的感官质量有明显改善作用。为了加强溶菌酶的溶菌作用和防腐效果,目前正在研究将溶菌酶与其它物质和防腐剂混合使用的方法。例如,将溶菌酶与甘氨酸混合使用,其防腐效果远远高于单独使用溶菌酶。因为甘氨酸含量达到一定程度时,能抑制微生物细胞壁的生长,这种作用对革兰氏阳性菌和阴性菌均有效,从而增强了溶菌酶的溶菌作用。溶菌酶已被联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)接受为干酪等食品的防腐剂。各国已广泛将溶菌酶添加到各种食品中以提高产品保存期和质量。溶菌酶热稳定性好,使用pH值范围宽,对于常温乳制品微生物中的革兰氏阳性菌将会有效。3-多聚赖氨酸ε-多聚赖氨酸是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物类食品防腐剂。它是日本酒井平一和岛昭二2位博士在筛选大量有价值的放线菌时发现的一种新型聚合物。它由25~30个赖氨酸残基聚合而成,经过研究发现,其具有强烈的抑菌能力,可以作为防腐剂用于食品的保鲜。ε-多聚赖氨酸抑菌广谱,在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果。ε-多聚赖氨酸对大肠杆菌、沙门氏菌等天然防腐剂不易抑制的革兰氏阴性菌抑菌效果非常好,而且其对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用。ε-多聚赖氨酸添加于食品中仅需微量就能产生效果,且不会影响食品口味,可作为食品的天然保存剂。它天然安全,符合消费者的健康需求。在日本,利用ε-多聚赖氨酸作为食品保存剂的生产规模发展迅速,市场规模达数十亿日元。ε-多聚赖氨酸应用于糕点、面包食品中,能有效地抑制耐热性芽孢杆菌的增殖,延长保存期;应用于低糖低热量食品,如乳蛋白冰淇淋、奶油制品等,可改善其保存性;在低温软罐头食品中加微量ε-多聚赖氨酸可防止杀菌后产生异味;在冷藏食品中添加ε-多聚赖氨酸能起到保证质量的效果。ε-多聚赖氨酸易溶于水,使用pH值范围广,热稳定性好,作为抑菌剂在食品中使用时,通常与其它物质配合使用,以达到增效和经济的目的。与甘氨酸配合,用量为0.01%~10.00%时,可应用于牛奶防腐。1989年日本窒素公司首先用生物技术方法生产ε-聚赖氨酸,并允许在日本使用,之后韩国也允许作为食品添加剂使用。在美国和欧洲,主要使用山梨酸作为防腐剂,2003年FDA已正式批准ε-多聚赖氨酸作为天然食品添加剂。4乳铁蛋白的活性多肽乳铁蛋白(Lactoferrin,简写为LF)是Groves于1960年首先从牛乳中分离获得,它与血清转铁蛋白(transferrin)在化学性质、抗菌特性等方面相似,但二者在氨基酸组成、抗原性和免疫作用方面存在很大的差别。乳铁蛋白具有广泛的生物学功能,如调节铁离子的吸收;参与某些炎症反应和对机体免疫系统进行调节,有广谱抗菌作用;还具有抗病毒,调节补体系统,促进细胞增殖等作用。人们发现,乳铁蛋白在水解后会产生某些具有特殊生理功能的小肽——活性多肽,它的抑菌效果是乳铁蛋白的400倍。1992年人们发现这种活性多肽是含25个氨基酸残基的抗菌肽,命名为LfcinB,其氨基酸序列如下:Phe-Lys-Cgs-Arg-ArsGin-Trp-Arg-Met-Lys-Lysho-Gly-Ala-Pro,Ser-lie-ThrCys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe。LfcinB能有效抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌,如大肠杆菌、奇异变形杆菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、结肠耶氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、白喉棒状杆菌,还对真菌(如白色念珠菌)、病毒、弓形虫和肿瘤细胞等有抑制作用,但对肠道菌的抑制作用具有选择性。动物肠道有益菌如粪链球菌、双歧杆菌和乳酸菌等对LfcinB具强抗性。LfcinB属小分子活性物质,不会引起动物抗原性反应,且具有耐热、在消化道中不易降解的特性。LfcinB有广谱的抑菌效能,并且具有热稳定性。添加这种天然抑菌剂到原奶中,完全符合生产工艺要求。目前,乳铁蛋白活性多肽的实验室制备主要是通过水解获得,成本比较高。人们正在致力于开发基因重组的产品。5纳他激素的使用纳他霉素是纳塔尔链霉菌需氧发酵产生的多烯大环内酯抗生素,在食品工业中作为食品防腐剂应用已超过20年,广泛应用到抑制干酪、肉和香肠表面以及果汁和葡萄酒工业中酵母菌和霉菌的生长。纳他霉素不能杀死细菌,只能抑制酵母菌和霉菌的生长。它不能溶解在水或脂肪中,在人体消化道内不能被吸收,所以对人类是安全的。美国FDA已经接受纳他霉素作为食品添加剂,国际食品规范委员会也正在评估纳他霉素的安全性和使用标准。通常1~10mg/kg的纳他霉素足以抑制霉菌和酵母菌的生长。纳他霉素不溶于水,但可溶于乙醇,最适pH值范围是4~7,且对高温敏感,另外它不能杀死或抑制细菌,所以相对于其它抑菌剂,纳他霉素并不是最适合常温液态乳制品微生物的抑制,但可以应用到干酪的生产工艺中。6牛奶fao/在奶配制与食品工业生产中使用了一种乳过氧化物酶是新鲜牛奶中天然存在的一种酶,在牛的整个泌乳期,乳过氧化物酶的浓度一直恒定为30mgL。乳过氧化物酶本身没有抑菌能力,但在过氧化氢(H硫氰酸盐和过氧化氢也是牛奶中天然存在的,只是浓度很低,额外加入这2种物质可以发挥乳过氧化物酶系统最大抑菌效果,可以使牛奶在30℃的温度下保持新鲜7~8h。这种方法对人和动物是安全的,也不影响牛奶的进一步加工,且成本低廉,费用约为1美分/L牛奶。经过15年的毒性实验研究,1989年FAO/WHO食品添加剂专家委员会认可了这种方法,1991年CodexAlimentariusCommission(国际食品法典委员会)认为这种方法使用安全。2002年澳大利亚新西兰食品权威组织(AustraliaNewZealandFoodAuthority’s,ANZFA)的乳过氧化物酶系统评估申请中也罗列了一些这种方法的标准。联合国粮农组织目前正大力推广这种方法。2005年12月2日