硕士研究生毕业答辩《南方红豆杉水提物联合吉非替尼抑制HGFMET通路抗人非小细胞肺癌移植瘤吉非替尼耐药的实验研究》论文模板

前言肺癌是导致肿瘤相关性死亡的最主要原因，每年超过100万人因肺癌死亡。其中，非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的75-85%，其中，腺癌（约占40%），鳞癌（约占35-45%）是NSCLC最主要的两种亚型[1]。在美国，每年约有22万患者被新诊断肺癌，16万肺癌患者死亡[2]，其中大部分NSCLC患者发现时即处于Ⅲ、Ⅳ期[3]，失去了手术根治的机会，5年生存率仅15%[4]。当前，以铂类为基础的双药化疗方案是NSCLC的一线治疗手段，近年来研究的以培美曲塞、多西紫杉醇为代表的单药化疗维持治疗也被NCCN指南推荐应用于临床。但是，以放、化疗为代表的NSCLC传统治疗手段目前无突破性的进展或研究显示能显著提升患者的生存期。随着对NSCLC自然病程的研究，众多分子标记物被发现，以表皮生长因子受体为靶点的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermalgrowthfactorreceptorkinaseinhibitors,EGFR-TKIs）已广泛应用于临床，2015年NCCN非小细胞肺癌指南推荐多种EGFR-TKIs用于NSCLC的一线、二线治疗。吉非替尼（易瑞沙）是一种可逆性EGFR-TKI，可以通过选择性的酶抑制剂或单克隆抗体竞争性结合细胞外配体结合位点可以阻断酪氨酸激酶活化，从而抑制EGFR的激活，在中晚期EGFR突变的非小细胞肺癌患者中广为应用。但是，以吉非替尼为代表的EGFR-TKIs耐药不可避免，其中位有效期仅为5-9个月，加之其昂贵的价格，使其进一步的应用受到了局限。当前，被普遍认同的EGFR-TKI的耐药机制为EGFR基因的二次突变学说和EGFR旁路HGF/MET通路的激活学说。HGF/MET通路激活导致的c-MET扩增或过表达是导致临床EGFR-TKIs治疗NSCLC失败的重要原因，在TKIs耐药的患者中发生率约为（5-22%），远远高于未经EGFR-TKIs治疗的患者（约3%）[5]。因此，寻找合适的药物延缓甚至克服由c-MET扩增或过表达导致的EGFR-TKIs耐药是当前NSCLC治疗中的重点和难点。以“整体观”、“辨证论治”为纲的中医药治疗具有多靶点、多效应、毒副作用小等优点，在肿瘤的治疗上具有独特的优势。基于此，中医药与EGFR-TKIs联合治疗非小细胞肺癌不失为一良策。南方红豆杉是我国传统中草药，在我国南方广泛，并在我省实现了产业化种植。其性平，味苦，有小毒，归心经，功效为消肿散结。我们的前期研究表明，南方红豆杉水提物的作用机制与紫杉醇不同[6]，南方红豆杉水提物与吉非替尼有协同作用，可以下调多种吉非替尼耐药的NSCLC细胞株HGF/MET下游的PI3K/AKT、STAT3、ERK通路相关蛋白和mRNA的表达。针对南方红豆杉水提物的安全性，本课题组亦通过前期研究得以验证：荷人肺癌A549裸鼠连续30天予高、中、低剂量的南方红豆杉水提物灌胃后，其血常规、生化指标均正常且与生理盐水给药的对照组相较无显著性差异。为了进一步研究南方红豆杉水提物对HGF/MET信号通路的作用，明确南方红豆杉水提物的作用靶点，本课题选取1种吉非替尼敏感（PC9）人肺癌细胞株，3种吉非替尼耐药（PC9/R、A549、H1975）的人肺癌细胞株构建裸鼠移植瘤模型，以裸鼠移植瘤为研究对象，采用Western-blot法检测MET、ErbB3及其磷酸化的蛋白表达，采用RT-PCR法检测MET、ErbB3的mRNA表达，探讨南方红豆杉水提物、南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷上述NSCLC肿瘤细胞裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关分子标记物的影响，明确南方红豆杉水提物对抗吉非替尼耐药的机制。

实验研究一、材料与方法（一）实验材料1.实验室浙江中医药大学动物实验中心浙江省中医药大学附属第一医院中心实验室2.实验细胞人肺腺癌A549（EGFR野生型，吉非替尼耐药耐药细胞株）细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所，人肺腺癌H1975（EGFRexon20T790M-L858R，吉非替尼耐药细胞株）、PC9（EGFRexonl9delE746-A750吉非替尼敏感细胞株）、PC9/R（EGFR突变型，吉非替尼耐药细胞株）细胞株由同济大学附属上海肺科医院周彩存教授惠赠。3.实验动物雄性BALB/c裸鼠180只，4-6周龄，体重16-18g，（SPF级，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016）。4.动物受试药（1）南方红豆杉饮片购于浙江中医药大学附属第一医院中药房，生产商为宁波泰康红豆杉生物工程有限公司，生产批号：100513。（2）吉非替尼标准品:由AstraZenecaUKLimited提供，规格:250mg/片，批准文号：国药准字J20100014。（3）生理盐水：购于浙江省中医院西药房，生厂商为杭州民生药业集团有限公司。5.实验仪器SENCOR-201旋转蒸发仪上海中顺生物科技有限公司AL204/01型电子天平瑞士梅特勒公司DGG-9070A电热恒温鼓风干燥箱上海森信实验仪器有限公司DK-80型电热恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司3111型水套式CO2细胞培养箱美国Thermo公司细胞培养瓶、培养皿、96孔板美国CORNING公司1285型单人生物安全柜美国Thermo公司CL31R型大容量冷冻离心机美国Thermo公司CL21R型微量高速冷冻离心机美国Thermo公司Elx808型酶标仪美国BioTek公司702型-80℃超低温冰箱美国Thermo公司SIM-F140型制冰机日本SANYO公司NanopureUV/UF型超纯水器美国Thermo公司MP4+ChemidocXRS型蛋白印记检测系统美国Bio-Rad公司REC2304型液相层析柜美国REVCO公司ESHK02型侧摆脱色摇床江苏碧云天生物技术研究所ECF011型手掌型微型离心机江苏碧云天生物技术研究所ESHK05型微型振荡器江苏碧云天生物技术研究所Thermocell型干式恒温器杭州博日科技有限公司BX20型荧光显微镜摄像机日本OLYMPUS公司Western-Blot套装设备美国Bio-Rad公司核酸电泳仪及电泳槽美国Bio-Rad公司NanoDrop1000紫外分光光度计美国Thermo公司ABI9700PCR扩增仪美国ABI公司ABI7500全自动荧光定量PCR仪美国ABI公司384孔板（PCR-384M2-C）美国Axygen公司6.实验试剂（1）细胞培养试剂GIBCO胎牛血清：美国GIBCO公司RPMI-1640培养液：科益生物技术有限公司F12-K培养液:吉诺生物医药技术有限公司DMEM高糖培养液:科益生物技术有限公司0.25%胰酶-EDTA：吉诺生物医药技术有限公司二甲基亚砜（DMSO）：美国Sigma公司0.01MPBS：科益生物技术有限公司（2）Western-blot试剂RIPA裂解液（强）：江苏碧云天生物技术有限公司蛋白酶抑制剂：杭州科易生物技术有限公司磷酸酶抑制剂：杭州科易生物技术有限公司Tris:美国AMRESCO公司1.0mol/LTris•HCl（pH6.8和7.5）：杭州科易生物技术有限公司

1.5

mol/LTris•HCl（pH8.8）：杭州科易生物技术有限公司

30％Acr/Bic（29：1）：杭州科易生物技术有限公司

2*上样缓冲液：杭州科易生物技术有限公司

5*上样缓冲液：杭州科易生物技术有限公司

蛋白标准品：杭州科易生物技术有限公司过硫酸胺（APS）：爱建德固赛引发剂有限公司丙稀酰胺（Acr）：美国AMRESCO公司十二烷基磺酸钠（SDS）：美国AMRESCO公司Tween-20：美国Bio-Rad公司TEMED：美国Bio-Rad公司甘氨酸（Glycine）：美国AMRESCO公司NaCl：上海试四赫维化工有限公司ECL化学发光试剂盒：美国Millipore公司PVDF膜：美国Millipore公司膜再生液：杭州科易生物技术有限公司脱脂奶粉：上海光明乳业股份有限公司溴酚兰、甘油、β-巯基乙醇：美国Sigma公司蛋白Marker:加拿大Fermentes公司β-actin一抗：美国Abcam公司Met、p-Met、ErbB3、p-ErbB3一抗:美国CellSignalingTechnology公司羊抗鼠、羊抗兔二抗：美国SantaCruz公司（3）RT-PCR试剂RNAisoPlus：宝生物工程（大连）有限公司焦炭酸二乙酯（DEPC）：宝生物工程（大连）有限公司PrimeScriptRTMasterMix：宝生物工程（大连）有限公司SYBRPremixEXTaq：宝生物工程（大连）有限公司7.主要试剂的制备（1）10％SDSSDS（十二烷基磺酸钠）10g蒸馏水至100ml50℃水浴下溶解，室温保存。SDS需在通风柜内取样。（2）10％过硫酸铵（APS）过硫酸铵0.1g超纯水1.0ml现配现用，4度不超过一周。（3）10×电泳缓冲液Tris30.3g甘氨酸187.7gSDS10g蒸馏水至1000ml混匀后室温保存。1×电泳缓冲液：每100ml加蒸馏水至1L。（4）10×转移缓冲液Tris58g甘氨酸29gSDS3.7g蒸馏水至1000ml混匀后室温保存。1×转移缓冲液：每100ml加入200ml甲醇，蒸馏水至1L。（5）10×TBS缓冲液1mol/LTris·HCl（pH7.5）100mlNaCl88g蒸馏水至1000ml混匀后室温保存。（6）1×TBST缓冲液Tween20200ul-2ml10×TBS100ml蒸馏水至1000ml（6）封闭液（5％脱脂奶粉）脱脂奶粉（国产，光明牌）5g1×TBST100ml（二）实验方法1.动物受试药的制备（1）南方红豆杉水提物配制将40g南方红豆杉饮片置于医用不锈钢锅，浸泡过夜，加8倍水煮沸30min，倒出药液，后加8倍水煮沸20min，再加5倍水煮沸20min，将3次药液经真空抽滤器过滤，置于电磁炉上浓缩至终浓度为104mg（生药量）/ml，按每只小鼠灌胃剂量0.1ml/10克浓缩药液，过滤除菌，-20℃保存备用。（2）吉非替尼药液配置根据“人和动物体表面积折算的等效剂量”比率表，将吉非替尼片（易瑞沙）250mg，配制成5mg/ml的混悬液，用生理盐水溶解，按每只裸鼠灌胃剂量0.1ml/10克定容，过滤除菌，-20℃保存备用。2.人非小细胞肺癌细胞系的复苏、冻存、计数及培养和传代（1）细胞的复苏①操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管爆裂可能造成操作人员的伤害。②将保存在-80℃冰箱中装有各细胞株的冻存管迅速置于37℃恒温水浴中，边摇边融。③待溶解后，用酒精消毒后开启，用移液器吸出细胞悬液，注入含3-5ml10%胎牛血清培养液的15ml离心管中。④混匀后800r/min离心5min，去上清液，加入含10%胎牛血清的培养液3ml，混匀，移至25cm2培养瓶中。⑤再加入3ml培养液，置5%CO2，37℃培养箱中孵育。（2）细胞的冻存①对数生长期的细胞，冻存前24小时换液，使细胞处于良好的营养状态。②按下述方法制备细胞冻存培养基:无血清培养基7/10，FBS2/10，DMSO1/10。③离心收获细胞，计数，800rpm离心5分钟，去上清。④沉淀加含保护液的培养基，计数，调整至5×106/ml左右。⑤用吸管轻轻吹打使细胞均匀，1ml管分装到无菌冻存管内。⑥用封口胶，将冻存管口封严。封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。⑦按下列顺序降温：室温→4℃（30min）→低温冰箱-20℃（30min）→超低温冰箱-80℃（数天）→液氮（长期）。（3）细胞的计数①将血细胞计数板和盖玻片用75%酒精擦净，干燥后将盖玻片放在计数室。②收集细胞，用完全培养基将细胞做适当稀释，微量加样器吸取10ul细胞于计数板上盖玻片一端将液体注入其下方的计数室内。③静置1分钟，显微镜下观察并计算出四角大格内的细胞数。④将计数结果按以下公式计算出细胞密度：细胞密度（万/ml）=(四大格细胞总数/4)*10，000*稀释倍数。（4）细胞的培养与传代①人肺腺癌细胞株在含10%胎牛血清的培养液中培养（其中A549细胞株培养液为F12-K；PC9、PC9/R细胞株培养液为DMEM；H1975细胞株培养液为1640），培养箱保持在5%CO2、37℃、饱和湿度条件下，根据细胞生长状态每1～2天更换培养液1次。②待细胞单层铺满培养瓶后，弃去培养液，用PBS洗去残余培养液，加消化液（0.25%胰酶-EDTA）1-2ml，置培养箱内2～3min，再把培养瓶放倒置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大，细胞变圆且已有细胞开始悬浮时，加入1-1.5倍于消化液的含10%胎牛血清的培养液终止消化。③轻轻反复吹打培养瓶底部，将细胞悬液移入离心管中，800rpm离心5min，弃上清液。④再用含10%胎牛血清的培养液重悬细胞，细胞密度控制在105个/ml左右，移入培养瓶中，于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱培养。⑤每1～2天换液1次，3～4天传代1次。取对数生长期细胞进行实验。3.裸鼠移植瘤模型的建立与分组采用BALB/c裸鼠180只进行实验（A549、PC9、PC9/R、H1975，每种细胞株40只）。取处于对数生长期人非小细胞肺癌细胞，制成单细胞悬液，PC9、PC9/R、H1975浓度调整为1-2×106/ml，A549浓度调整为5-10×106/ml。将不同人非小细胞肺癌细胞株接种于裸鼠右腋皮下，每只裸鼠右腋皮下接种0.2ml，10天后，剔除未成瘤裸鼠。裸鼠成瘤后，计算成瘤率。每种细胞株接种的BALB/c裸鼠均随机分为4组，分别为南方红豆杉水提物组、吉非替尼组、南方红豆杉联合吉非替尼组以及对照组。每组10只。连续灌胃4周。其中，南方红豆杉水提物组灌胃量为南方红豆杉10.4mg/10g/d，吉非替尼组灌胃量为吉非替尼0.5mg/10g/d，联合组灌胃量为南方红豆杉10.4mg/10g/d+吉非替尼0.5mg/10g/d，对照组灌胃量为NS0.1ml/10g/d。4.裸鼠移植瘤瘤块组织的提取上述成瘤裸鼠结束灌胃后24h，在冰上取瘤块组织，每只裸鼠瘤块保持薄膜完整，-80℃保存备用，待行Western-Blot、RT-PCR等试验。5.对裸鼠移植瘤目的蛋白表达的Western-Blot检测（1）裸鼠移植瘤蛋白的提取①取适量RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸化酶抑制剂，于冰上放置融解，混匀，短暂离心使沉到管底。②取绿豆样大的移植瘤组织，先用预冷的PBS或生理盐水漂洗移植瘤组织数次，以清除表面的血迹，然后将组织切成1mm见方的小组织块，置于EP管中。③按每20mg组织加入150ul~250ul的RIPA裂解液，1.5~2.5ul的蛋白酶抑制剂，1.5~2.5ul的蛋白磷酸化酶抑制剂（RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸化酶抑制剂的比例为100:1）。④在冰上用电动匀浆器匀浆组织，至组织充分裂解。⑤于冰上静置组织30min，每10min震荡一次，每次30-60s。⑥离心机预冷后4℃下12000rpm离心15min。⑦取上清液转移至于EP管中。⑧4℃下重复离心15min一次，取上清液转移至EP管中，可放置于-80℃冰箱中保存备用。（2）BCA法测定蛋白浓度①将蛋白标准品放置于冰上溶解、混匀。②根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀，工作液呈绿色。③将蛋白标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的标准品孔中，加蒸馏水补足到20μl。④加适当体积待测蛋白到96孔板的样品孔中，加蒸馏水稀释至20μl（待测蛋白与蒸馏水比例为1:24）。⑤各孔加入200μlBCA工作液。⑥培养箱中孵育30min，酶标仪在562nM处测定OD值，所得数据用excel软件绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度及蛋白样本的上样体积，上样量统一为30ug。（3）SDS－PAGE电泳①清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。②灌胶与上样（配胶和灌胶在通风柜内操作）：a玻璃板对齐后垂直放入夹中后卡紧，双蒸水检漏5-10min。准备灌胶。b配制8-12％分离胶，最后加入TEMED后立即摇匀、灌胶，待胶面升到绿带中间线高度时即可。胶上加1ml异丙醇以去除气泡及加速凝胶。加异丙醇时尽量避免对凝胶的冲击，胶面均匀铺上一层异丙醇即可。c上层液体与胶之间出现一条折射带时，胶已凝固。充分凝固后倒去异丙醇并用蒸馏水冲洗一遍，吸水纸吸干。d配制5％浓缩胶，最后加入TEMED后立即摇匀，灌胶，插入梳子，插梳子时保持正中及水平。灌胶时避免胶中产生气泡。凝固过程中胶面尤其是胶的两边可能会有所下降，应适时补加凝胶。e根据移植瘤蛋白的浓度将蛋白样品按1︰1比例加入2×SDS或5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5-10min使蛋白变性，立即放冰上。根据所测样品蛋白浓度，计算含30μg蛋白的溶液体积为上样量。可置于-80℃冰箱保存。f浓缩胶凝固后，将玻璃板和胶一起拿出，放入电泳槽。电泳槽中由内到外倒入足够的电泳液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，开始上样。g用微量加样器贴壁吸取样品，加样器枪头插至加样孔中垂直缓慢加入样品，不能抵住玻板，避免胶与玻板脱离。样品沉入加样孔底部后再撤出加样器。③电泳：插上电源，开始电泳，注意正负极。电泳电压浓缩胶60V～80V，分离胶90-120V，时间2～4h。溴酚蓝到达胶底端时，终止电泳。（4）转膜①将剪好的PVDF膜（5cm×7cm，剪右上角作为正面标记）置于甲醇中浸泡处理10min（浸透即可），然后在转移缓冲液中浸泡10-15min以除去甲醇。②在加有转移缓冲液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、海绵垫、玻棒、剪好的滤纸和处理过的PVDF膜。③将夹子打开使黑面保持水平，上面垫一张海绵垫及四张滤纸，用玻棒擀走里面的气泡。④将玻璃板撬开，将浓缩胶刮去，剥下分离胶盖于滤纸上，使其与滤纸对齐，用玻棒擀去气泡。将PVDF膜盖于胶上（盖满整个胶）并除去气泡。在膜上盖四张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。膜和胶之间不能有气泡。胶在转移缓冲液中浸泡数分钟有利于SDS的去除，利于转膜。⑤将夹子放入转移槽中，夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。槽中加满转移缓冲液，4℃层析柜中30mA转膜过夜，或250mA转膜2.5h。（5）免疫反应①转膜后将膜用TBST淋洗一遍，然后移至含有封闭液（10%脱脂奶粉）的平皿中（膜的正面即蛋白面朝上），室温下脱色摇床上摇动封闭1h或4℃封闭过夜。②将一抗用封闭液稀释至适当浓度（15ml离心管中，3ml）。从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜的蛋白面朝内卷曲置入15ml离心管中，与一抗充分接触，室温下旋转孵育2-3h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。③同上方法准备二抗稀释液并与膜充分接触，室温下孵育1-2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。（6）化学发光，显影，拍照①将ECL发光试剂盒中A、B两种试剂在离心管内等体积混合。将膜蛋白面朝上放在保鲜膜上，将ECL混合液滴加在PVDF膜上，避光反应3-5min，放入蛋白印记检测系统的暗箱内。②根据信号的强弱适当调整曝光拍摄时间（一般为1～5min），以达最佳效果，记录实验结果。凝胶图象分析：将不同时间所拍图片，以β-actin内参作为进行蛋白灰度分析。6.对裸鼠移植瘤目的mRNA表达的RT-PCR检测（1）总RNA的提取①剪取超低温冻结的瘤块组织约绿豆大小（80-100mg）放入1.5ml离心管中。②在离心管中内加入1mlRNAiosPlus，剪碎瘤块组织后，把离心管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状，室温下静置5分钟。③4℃12000rpm离心5分钟，小心吸取上清液，移到新的离心管中（切勿吸取沉淀）。④向上述离心管中加入200μl氯仿（为RNAiosPlus体积的1/5），剧烈振荡30秒，充分乳化后室温静置10分钟。⑤4℃12000rpm离心15分钟，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸取白色中间层）。上清液量约为600μl。⑥向上清液中加入等体积异丙醇（约600μl），上下颠倒混匀后室温下静置10分钟，4℃12000g离心10分钟。⑦小心弃去上清，缓慢沿离心管壁加入75%的乙醇1ml（0.1%DEPC水配制），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，4℃12000g离心5分钟后小心弃去乙醇。⑧沉淀室温干燥90分钟后，加入0.1%DEPC水100u溶解沉淀，吹打混匀。⑨取1-2μl溶解后的RNA用紫外分光光度计上测定RNA浓度，确定RNA的纯度及浓度，A260/A280应在1.8～2.0之间，RNA浓度应在300-600ng/μl之间。（2）逆转录①按逆转录所需RNA量，取不同体积的RNA样品，用DEPC水调节使其在反应体系中保持统一浓度。②反应体系：TotalRNA—5×PrimeScriptRTMasterMix2μlRnaseFreedH2Oupto10μlTotal10μl③反应条件：37℃15min85℃5sec4℃forever（3）实时荧光定量PCR①引物：GAPDH上游引物为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’。GAPDH下游引物为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。MET上游引物为5’-CTGCCTGCAATCTACAAGGT-3’。MET下游引物为5’-ATGGTCAGCCTTGTCCCTC-3’。ErbB3上游引物为5’-GACCCAGGTCTACGATGGGAA-3’。ErbB3下游引物为5’-GTGAGCTGAGTCAAGCGGAG-3’。②反应体系SYBRPremixExTaqTM(2×)5μlPCRForwardPrimer(10μm)0.2μlPCRReversePrimer(10μm)0.2μlROXReferenceDye(50×)0.2μlDNA模板1μldH2O3.4μlTotal10μl③反应条件Stage1：预变性Reps：195℃30sec.Stage2：PCR反应Reps：4095℃5sec.60℃34sec.Stage3：溶解曲线分析95℃15sec.60℃1min.95℃15sec.④荧光定量结果采用2-△△ct方法分析，统计相对表达量的差值RQ值③荧光定量结果采用2-△△ct方法分析，统计相对表达量的差值RQ值7.统计学处理所有数据输入计算机，用SPSS17.0统计软件分析处理。计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，检测计量资料数据是否符合正态分布及方差齐性。两组间差异选用独立样本t检验，多组间差异选用ANOVA单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义，P<0.01认为有显著性差异。二、结果（一）4种非小细胞肺癌细胞系裸鼠移植瘤模型的建立将4种细胞系的细胞以1×107个/ml的浓度接种于裸鼠，每只裸鼠接种0.2ml，约2×107个细胞，观察7-14天可见，接种PC9、PC9/R、A549、H19753种细胞系裸鼠的成瘤只数分别为40只、40只、36只、40只。可见PC9、PC9/R、H1975移植瘤裸鼠的成瘤率均为100%，A549移植瘤裸鼠的成瘤率为90%。图1：成瘤裸鼠个数表1：4种非小细胞肺癌细胞系裸鼠移植瘤的成瘤率PC9PC9/RA549H1975成瘤裸鼠40403640未成瘤裸鼠0040成瘤率（%）100%100%90%100%（二）南方红豆杉水提物联合吉非替尼对4种非小细胞肺癌细胞系移植瘤HGF/MET通路相关蛋白表达的影响1.南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9裸鼠移植瘤HGF/MET通路通路相关蛋白表达的影响由下图和下表可见，因PC9为吉非替尼敏感细胞株，因此吉非替尼组、南方红豆杉水提物联合吉非替尼组裸鼠在用药后瘤块组织组织消失。在荷PC9裸鼠移植瘤中，南方红豆杉水提物单药组较对照组能够显著下调荷PC9裸鼠移植瘤p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01）。上调MET的表达（P<0.01）。图2-1：荷PC9裸鼠移植瘤蛋白表达水平图2-2：荷PC9裸鼠移植瘤蛋白灰度比注：1.H组为南方红豆杉水提物组，D组为对照组。表2：南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9裸鼠移植瘤蛋白表达影响指标组别HDβ-actine1.0001.000MET1.033±0.025**0.960±0.010p-MET0.543±0.015**1.327±0.015ERBB31.160±0.020**0.840±0.010p-ERBB30.290±0.017**1.476±0.031注：H组为南方红豆杉水提物组，D组为对照组。2.与对照组比较，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.012.南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9/R裸鼠移植瘤HGF/MET通路通路相关蛋白表达的影响由下图和下表可见，吉非替尼单药组能够显著上调荷PC9/R裸鼠移植瘤MET、p-MET的表达（P<0.01），下调ERBB3的表达（P<0.05），显著下调p-ERBB3的表达（P<0.01）。相较于吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼组能够显著下调荷PC9/R裸鼠移植瘤MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药组较对照组亦能够显著下调MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01）。图3-1：PC9/R裸鼠移植瘤蛋白表达水平图3-2：荷PC9/R裸鼠移植瘤蛋白灰度比注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。表3：南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9/R裸鼠移植瘤蛋白表达影响指标组别HGH+GDβ-actine1.0001.0001.0001.000MET0.747±0.046**▲1.313±0.038**0.777±0.056**▲0.973±0.090▲p-MET0.707±0.029**▲1.573±0.125**0.480±0.020**▲1.177±0.116▲ERBB30.737±0.021**▲1.110±0.036*0.983±0.038**▲1.180±0.040△p-ERBB30.793±0.006**▲0.690±0.010**0.483±0.012**▲2.256±0.032▲注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。2.与对照组比较，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；与吉非替尼组单药组比较，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。3.南方红豆杉水提物联合吉非替尼对A549移植瘤HGF/MET通路通路相关蛋白表达的影响由下图和下表可见，吉非替尼单药组能够显著上调MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01）。相较于吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼组能够显著下调荷A549裸鼠移植瘤MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药组较对照组能够显著下调ERBB3的表达（P<0.01），能上调MET、p-MET、p-ERBB3的表达（P<0.01）。图4-1：荷A549裸鼠移植瘤蛋白表达水平图4-2：荷A549裸鼠移植瘤蛋白灰度比注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。表4：南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷A549裸鼠移植瘤蛋白表达影响指标组别HGH+GDβ-actine1.0001.0001.0001.000MET1.133±0.072**▲1.507±0.025**0.767±0.045**▲0.377±0.006▲p-MET0.947±0.025**▲1.453±0.031**0.623±0.006**▲0.443±0.06▲ERBB30.410±0.010**▲1.217±0.035**1.097±0.047**▲0.823±0.015▲p-ERBB30.867±0.012**▲1.470±0.026**0.540±0.010▲0.560±0.000▲注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。2.与对照组比较，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；与吉非替尼组单药组比较，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。4.南方红豆杉水提物联合吉非替尼对H1975移植瘤HGF/MET通路通路相关蛋白表达的影响由下图和下表可见，吉非替尼单药组能够显著上调ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01）。相较于吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼组能够显著下调荷H1975裸鼠移植瘤p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01），上调MET的表达（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药组较对照组亦能够显著下调MET、p-MET、p-ERBB3的表达（P<0.01），上调ERBB3的表达（P<0.01）。图5-1：荷A549裸鼠移植瘤蛋白表达水平图5-2：荷H1975裸鼠移植瘤蛋白灰度比注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。表5：南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷H1975裸鼠移植瘤蛋白表达影响指标组别HGH+GDβ-actine1.0001.0001.0001.000MET0.260±0.013**▲1.057±0.028**1.411±0.019**▲1.176±0.174▲p-MET0.497±0.015**▲1.333±0.014**0.592±0.009**▲1.493±0.036▲ERBB31.835±0.022**▲1.006±0.014**0.638±0.009▲0.612±0.010▲p-ERBB30.494±0.013**▲1.430±0.007**0.492±0.003**▲1.224±0.010▲注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。2.与对照组比较，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；与吉非替尼组单药组比较，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。（三）南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9、PC9/R、A549、H1975裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关mRNA表达的影响1.南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关mRNA表达的影响由下图、下表可见，在荷PC9裸鼠移植瘤中，南方红豆杉水提物单药灌胃组的MET、ERBB3mRNARQ值均显著低于对照组（P<0.01）。图6：荷PC移植瘤mRNA表达RQ值注：1.H组为南方红豆杉水提物组，D组为对照组。表6：南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9裸鼠移植瘤mRNARQ值表达影响指标组别HDMET0.482±0.087**1.000ERBB30.253±0.038**1.000注：1.H组为南方红豆杉水提物组，D组为对照组。2.与对照组比较，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01。2.南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9/R裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关mRNA表达的影响由下图、下表可见，在荷PC9/R裸鼠移植瘤中，吉非替尼单药灌胃组较对照组能够下调METmRNA的表达（P<0.05），ERBB3mRNA较对照组无显著性差异。较吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼能下调MET的表达（P<0.05），显著下调ERBB3的表达（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药灌胃组的MET、ERBB3mRNARQ值均在统计学意义上显著低于对照组（P<0.01）。图7：荷PC9/R裸鼠移植瘤mRNA表达RQ值注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。表7：南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷PC9/R裸鼠移植瘤mRNA表达影响指标组别HGH+GDMET0.474±0.083**▲0.800±0.126*0.640±0.130**△1.000△ERBB30.683±0.040*▲1.059±0.2230.416±0.130**▲1.000注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。2.与对照组比较，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；与吉非替尼组单药组比较，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。3.南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷A549裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关mRNA表达的影响由下图、下表可见，在荷A549裸鼠移植瘤中，吉非替尼单药组较对照组能够显著上调MET、ERBB3mRNA的表达（P<0.01）。较吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼能显著下调MET的表达（P<0.01），上调ERBB3的表达。而南方红豆杉水提物单药能够显著上调MET、ERBB3mRNA的表达（P<0.01）。图8：荷A549裸鼠移植瘤mRNA表达RQ值注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。表8：南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷A549裸鼠移植瘤mRNA表达影响指标组别HGH+GDMET1.359±0.034**▲1.701±0.065**1.103±0.017*▲1.000▲ERBB31.210±0.007**▲0.731±0.040**1.248±0.017**▲1.000▲注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。2.与对照组比较，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；与吉非替尼组单药组比较，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。4.南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷H1975裸鼠移植瘤HGF/MET通路相关mRNA表达的影响由下图、下表可见，在荷H1975裸鼠移植瘤中，吉非替尼单药组较对照组能够显著上调ERBB3mRNA的表达（P<0.01），METmRNA上调无统计学意义。较吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼能显著下调ERBB3的表达，显著上调MET的表达（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药灌胃组的MET、ERBB3mRNARQ值均在统计学意义显著低于对照组（P<0.01）。图9：荷H1975裸鼠移植瘤mRNA表达RQ值注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。表9：南方红豆杉水提物联合吉非替尼对荷H1975裸鼠移植瘤mRNA表达影响指标组别HGH+GDMET0.713±0.050**▲1.221±0.0821.671±0.275**▲1.000ERBB30.564±0.094**▲2.615±0.202**0.947±0.124▲1.000▲注：1.H组为南方红豆杉水提物组，G组为吉非替尼组，H+G组为吉非替尼联合南方红豆杉水提物组，D组为对照组。2.与对照组比较，*表示0.01<P<0.05，**表示P<0.01；与吉非替尼组单药组比较，△表示0.01<P<0.05，▲表示P<0.01。三、分析与讨论（一）南方红豆杉的抗肿瘤作用1.中医对红豆杉的认识南方红豆杉是红豆杉的一种，作为传统中药材，红豆杉在我国历史上广为应用，但是“红豆杉”之名在民国时期才出现。红豆杉古称“血榧”、“赤杉”、“红豆树”等，《钦定授时通考》记载榧“味甘，平涩，无毒，治五痔，去三虫，轻身明目”，这与《中药辞海》记载的红豆杉“驱虫”的功效相近[7]。关于红豆杉的临床功效，当今《中药大辞典》等工具书仅有“通经利尿”、“治食积，驱蛔虫”的作用记载[8,9]。这样的描述与红豆杉临床用于治疗消渴、癌病、风湿的作用相比过于局限。也说明当前对红豆杉药性理论等研究和考证尚不完善。关于红豆杉的性味、归经与功效，李良松等[10]通过整理史料，提出了红豆杉味甘、微苦，性平，入肺、胃、大肠经，功效为解毒散积、活络止痛、利水消肿、化食驱虫。主治邪毒内蕴所致各种疾患，脾胃升降失调所致的胃脘疼痛、大便秘结，气滞血瘀所致食积、纳呆，水肿、糖尿病，痔疮和出血，蛔虫、绦虫病及牛皮癣等皮肤病。2.南方红豆杉抗肿瘤的成分研究（1）南方红豆杉的主要成分及其抗肿瘤作用南方红豆杉的主要活性成分为紫杉烷类化合物、黄酮类物质、多糖类化合物，以及甾体类、木脂素类、倍半萜类、K、Ca、Zn、Mg、Cu等有机化合物，无机元素。南方红豆杉最广为人知的抗肿瘤成分即为紫杉醇，它在南方红豆杉中的含量极少，可以通过与微管蛋白结合，抑制微管生理性解聚，使肿瘤细胞细胞的有丝分裂过程阻滞于G2期，从而达到抗肿瘤的作用[11]。紫杉醇自1992年在美国上市后，因其广谱的抗肿瘤作用，当前已广泛应用于肺癌、乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤的化学治疗。也有现代研究表明，红豆杉多糖亦有抗肿瘤作用，韩飞飞[12]通过动物实验研究发现红豆杉中多糖对荷S180肉瘤小鼠、荷levis肺癌小鼠和荷HepA肺癌小鼠的肿瘤具有一定的抑制作用，且这种抑制作用与红豆杉多糖浓度正相关；此外，红豆杉多糖还可以提高荷瘤小鼠的耐缺氧能力，荷瘤小鼠游泳耐力，并延长荷瘤小鼠的生命。红豆杉黄酮亦具有一定的抗肿瘤活性，木犀草素-7-甲醚是一种红豆杉黄酮物质，有研究表明，在IC(50)值为1.291g/mL时，木犀草素-7-甲醚有较强的抗肺癌作用[13]。（2）南方红豆杉水提物的抗肿瘤作用南方红豆杉水提物是指以中药水煎剂方法为指导，通过规范的方法，用100℃水提取南方红豆杉溶于水的成分。南方红豆杉水提物的具体成分尚不明确，可能包括红豆杉多糖、红豆杉黄酮等物质。紫杉醇是一种紫杉烷类物质，在60℃以上，紫杉醇即会迅速降解[14]。因此，在100℃提取的南方红豆杉水提物理论上不应有紫杉醇存在，而南方红豆杉水提物抗肿瘤的机制可能与紫杉醇不尽相同。我们的前期研究通过对人NSCLC细胞系A549细胞的研究验证了这一观点[6,15,16]，首先，南方红豆杉通过诱导细胞凋亡而非细胞毒作用达到抗肿瘤的效果；其次，南方红豆杉的抗肿瘤效应在G0/G1期，而非紫杉醇的G2或M期；第三，在细胞形态学上，南方红豆杉水提物作用的细胞形态以凋亡为主，而紫杉醇作用的细胞形态则以坏死为主。针对荷A549细胞移植瘤裸鼠，我们研究发现，南方红豆杉可以显著下调Survivin及p-EGFR蛋白的表达，并能起到抑制移植瘤生长的作用[17]。并通过体内外研究进一步证实了南方红豆杉水提物对A549细胞及裸鼠移植瘤的作用是通过EGFR/MAPK信号通路实现的[18]。针对南方红豆杉水提物的毒性，我们通过动物实验得出，相对CTX，南方红豆杉水提物能够改善荷A549裸鼠的生存质量[19]，而予荷人肺癌A549裸鼠连续30天予高、中、低剂量的南方红豆杉水提物灌胃后，其血常规、生化指标均正常且与生理盐水给药的对照组相较无显著性差异。随着EGFR-TKIs的广泛应用，同时基于南方红豆杉的临床疗效观察，南方红豆杉与EGFR-TKIs的联合使用可能具有协同作用。并通过实验证明南方红豆杉水提物与吉非替尼有协同作用，可以下调多种吉非替尼耐药的NSCLC细胞株HGF/MET下游的PI3K/AKT、STAT3、ERK通路相关蛋白和mRNA的表达。综上可见，实验研究已证明南方红豆杉水提物具有抑瘤作用，与EGFR-TKIs联用有对抗EGFR-TKIs耐药，且这是通过EGFR下游通路实现的，而这些下游通路同时也是作为EGFR旁路HGF/MET的下游通路。（二）南方红豆杉水提物对裸鼠移植瘤HGF/MET信号通路作用的探讨1.HGF/MET通路与EGFR-TKI耐药（1）HGF/MET信号通路的激活可导致EGFR-TKIs耐药①MET的过表达、扩增与突变MET是一种原癌基因，它最早于1984年在一种骨肉瘤细胞株中被发现和提取[20]。其蛋白产物MET的配体是具有酪氨酸激酶活性的肝细胞生长因子/离散因子（hepaocytegrowthfactor/scatterfactor，HGF/SF）[21]。MET与HGF结合后，可促使Tyr1349与Tyr1356的磷酸化，并进一步激活跨膜的信号传导[22]。HGF/MET下游的信号信号传导通路包括ERBB3（HER3）/PI3K/AKT通路，MAPK/ERK通路，STAT通路，NF-ΚB通路，其中又以PI3K/AKT通路最为重要[23-25]。这些通路均已被研究证实与肿瘤的发生、发展相关。对这些下游通路相关基因、蛋白表达的研究为肿瘤的发展，EGFR-TKIs耐药的研究提供了一些潜在的靶点和分子标记。MET与肺癌的发生密切相关，其主要机制包括MET的过表达，MET的扩增与MET的突变。其中最常见的机制即为MET的过表达。有研究表明[26]，近60%的肺癌组织中有MET的过表达，约1-21%的病例有MET的扩增，MET的突变发生率较前两者低，在非小细胞肺癌中的出现比例约为5%-10%，可发生在胞浆区或胞外区，但其与HGF/MET通路的激活密切相关[27,28]。此外，MET可作为一个提示预后分子标志物，其过表达与扩增可导致肺癌患者更差的预后[29,30]。MET的过表达或扩增与EGFR-TKIs耐药亦相关。其机制可能是绕过被抑制的EGFR磷酸化激酶通路进行过表达或扩增，而扩增的MET通过旁路激活作用启动下游的信号转导，逃避EGFR-TKIs的杀伤作用，促进肿瘤细胞的增殖，进而导致EGFR-TKIs的耐药。约5%–22%出现EGRF-TKIs获得性耐药的NSCLC患者有MET基因的扩增[31-34]。有临床研究表明，在接受厄洛替尼或吉非替尼治疗后耐药的肺腺癌患者中，有21%出现了MET扩增，相较于未接受药物治疗的患者（3%出现MET扩增）有明显增加，说明了MET与获得性耐药相关[31]。体外实验亦证实，HCC827细胞系予递增浓度的吉非替尼后，可出现MET7q31.1至7q33.3区域的扩增[32]。②HGF的过表达HGF是一种多功能细胞因子，主要来自间质细胞，以旁分泌方式作用于邻近细胞，作为配体与细胞表面的受体即MET蛋白结合，激活酪氨酸激酶，具有较强的促有丝分裂，诱导上皮细胞迁移、侵袭以及诱导血管生成等作用。HGF的过表达在EGFR-TKIs耐药过程中亦起到了重要作用，有实验研究表明，HGF诱导的NSCLC细胞株可诱导MET的磷酸化，绕过EGFR，激活ERBB3(HER3)/PI3K/Akt和MAPK-ERK1/2等下游通路，促进组织细胞的活化增殖，导致EGFR-TKIs耐药[35]。由此我们可以推断，HGF的过表达，引起的MET磷酸化使肿瘤细胞不仅对厄洛替尼、吉非替尼等可逆性EGFR-TKI产生耐药，还会对不可逆EGFR-TKIs如阿法替尼产生耐药。最新也有研究认为HGF通过稳定某些肿瘤相关蛋白的活性进而引起EGFR-TKIs的临床耐药，这些蛋白包括酪氨酸激酶受体AXL、E-phA2以及CUB结构域包含蛋白1(CDCP1)等[36]。③ERBB3ERBB3(HER3)与ERBB1（HER1）、ERBB2(HER2)、ERBB4(HER4)共同构成了表皮生长因子家族，它具有酪氨酸激酶活性，由ERBB基因编码。近20年来，ERBBs与配体结合启动下游信号通路介导细胞的增殖，在肿瘤的发生发展中起到的作用已得到了共识。相较ERBB1、ERBB2透彻的研究，关于ERBB3的研究相对较少。原因之一是ERBB3胞内区缺乏能够被检测到的较强的酪氨酸激酶活化信号，其二是在肿瘤组织中较少发现ERBB3的突变[37]。但是近年来，ERBB3被发现与EGFR-TKIs的耐药相关。有研究表明，在MET扩增的EGFR耐药细胞株中，MET可能通过对ERBB3的转磷酸作用使其可以绕过被EGFR-TKIs阻滞活性的EGFR，从而激活下游通路[31]。EGFR-TKIs对EGFR的阻滞作用亦有可能导致ERBB3活性“代偿性”的增加[38]。④HGF/MET通路的激活与ERBB3由上文可见，MET的过表达或扩增在ERBB3介导EGFR-TKIs耐药密切相关。而MET的过表达、扩增或突变与HGF/MET信号通路的激活互为因果。因此，ERBB3是与HGF/MET信号通路激活密切相关的一种分子。有研究表明，ERBB3依赖的PI3K/AKT信号通路的激活是介导吉非替尼耐药的重要机制[39]。下图阐明了HGF/MET信号通路如何通过ERBB3介导了EGFR-TKI耐药。由图中可见，在EGFR被吉非替尼阻滞后，吉非替尼敏感细胞ERBB3下游的PI3K/AKT通路不能被激活，而在MET扩增的吉非替尼耐药细胞中，MET能够作用于ERBB3的胞内区域使PI3K/AKT信号通路激活，从而实现了EGFR-TKIs耐药。因此，同时研究ERBB3与HGF/MET通路具有重要意义。图10：HGF/MET信号通路与ERBB3介导吉非替尼耐药2.抗HGF/MET通路克服EGFR-TKI耐药的基础与临床研究针对HGF/MET通路的激活，当前出现了多种靶向药物，包括单克隆抗体如HGF单抗、MET单抗，非选择性抑制剂如克里唑替尼等，它们多与EGFR-TKIs联合应用。针对这些已应用于临床药物，或正进行临床试验的药物，当前已有多项研究成果。（1）基础研究①MET抑制剂：在荷人NSCLC裸鼠移植瘤模型中，MET单抗h224G11能够显著抑制小鼠移植瘤的生长，其联合长春瑞宾后能够更显著的抑制裸鼠移植瘤的生长[40]，另一项研究显示，厄洛替尼耐药的裸鼠移植瘤在给予MGCD265（1种小分子MET、VEGFR、Tie-2、RON阻滞剂）联合厄洛替尼能体现出显著的协同作用，且没有双药叠加的毒性[41]。Onartuzumab（1种MET单抗）联合厄洛替尼在荷NCI-H596裸鼠移植瘤上亦体现了显著的抑瘤作用[42]。②HGF抑制剂：在暴露于烟草致癌物下的HGF过表达转基因小鼠模型中，采用HGF单抗（L2G7）联合吉非替尼治疗的小鼠的成瘤率显著低于L2G7或吉非替尼单药治疗的小鼠[43]。③非选择性抑制剂：有研究表明，广谱激酶抑制剂Cabozantinib（XL184，MET，VEGFR-2和RET抑制剂）联合吉非替尼能够抑制吉非替尼耐药的HCC827GR6细胞EGFR、ERBB3的磷酸化作用，在荷HCC827GR6裸鼠移植瘤上，Cabozantinib单药或厄洛替尼单药均不能达到双药联合的肿瘤抑制作用[44]。此外，克里唑替尼联合不可逆EGFR-TKI阿法替尼或WZ4002能够抑制HCC827GR、H1975、PC9/R等细胞系裸鼠移植瘤的生长[45]。（2）临床研究①MET抑制剂：在一项纳入59位曾接受过治疗NSCLC患者的Ⅱ期临床研究中，Cabozantinib单药应用能达到PR人数5人，SD人数27人，PD人数10人，12周的疾病控制率为42%[46]。Onartuzumab在一项Ⅱ期临床研究中被更深一步的研究，该项研究共纳入了128位曾经治疗过的EGFR未突变的NSCLC患者，治疗组为Onartuzumab联合厄洛替尼，对照组为厄洛替尼联合安慰剂，结果显示，两组间PFS（HR，1.1；95%CI,0.7–1.6）值与OS（HR，0.8；95%CI，0.5–1.3）值无显著性差异。在亚组分析中可见，厄洛替尼联合Onartuzumab较厄洛替尼联合安慰剂在MET扩增的患者取得了较好的疗效[47,48]。②HGF抑制剂：在一项纳入15位亚洲裔的，多数曾接受过EGFR-TKI治疗（10人）的NSCLC（不可切除）患者的Ⅰb期临床研究中，HGF单抗Ficlatuzumab联合吉非替尼在最佳剂量下获得了如下临床结果，PR人数5人，SD人数4人，PD人数3人，中位治疗时间为12周（范围：3.6-40周）。基于以上结果，Ficlatuzumab将针对亚洲裔人群进行Ⅱ期的临床研究[49]。综上可见，尽管HGF/MET通路在基础和临床都有了一定数量的研究，特别是基础研究得出了METMab等HGF/MET通路抑制剂联合EGFR-TKIs对细胞和实验动物取得了一定的疗效，但是目前尚缺乏决定性的研究成果表明当前的HGF/MET抑制剂对延长患者的PFS、OS有显著性作用。此外，由于参与临床试验的药物在国内多未上市，上市的克里唑替尼价格昂贵，因此，研究中药HGF/MET通路抑制剂十分必要。3.南方红豆杉水提物抑制荷人NSCLC细胞株裸鼠移植瘤HGF/MET通路抗吉非替尼耐药（1）南方红豆杉水提物抑制荷人PC9裸鼠移植瘤HGF/MET通路的作用在荷PC9裸鼠移植瘤的mRNA表达上，南方红豆杉水提物单药的MET、ERBB3mRNARQ值均显著低于对照组（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药组较对照组能够显著下调p-MET、ERBB3、p-ERBB3蛋白的表达（P<0.01），上调MET蛋白的表达（P<0.01）。可见，南方红豆杉水提物单药能够在mRNA水平抑制荷PC9裸鼠移植瘤MET、ERBB3mRNA的表达，并能抑制p-MET、ERBB3、p-ERBB3蛋白的表达以达到抑制HGF/MET通路的作用。（2）南方红豆杉水提物抑制荷人PC9/R裸鼠移植瘤HGF/MET通路的作用在荷PC9/R裸鼠移植瘤的mRNA表达上，吉非替尼单药组较对照组能够下调METmRNA的表达（P<0.05），ERBB3mRNA较对照组无显著性差异。较吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼能下调MET的表达（P<0.05），显著下调ERBB3的表达（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药组的MET、ERBB3mRNARQ值均在统计学意义上显著低于对照组（P<0.01）。在蛋白表达上，吉非替尼单药组能够显著上调荷PC9/R裸鼠移植瘤MET、p-MET的表达（P<0.01），下调ERBB3的表达（P<0.05），显著下调p-ERBB3的表达（P<0.01）。相较于吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼组能够显著下调荷PC9/R裸鼠移植瘤MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药组较对照组亦能够显著下调MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01）。由此可见，对荷PC9/R裸鼠移植瘤，吉非替尼单药不能在mRNA水平上抑制MET、ERBB3mRNA的表达，但能在蛋白表达水平上上调MET、p-MET的表达，这一作用可能是通过MET蛋白的过表达或MET配体HGF过表达实现的。南方红豆杉水提物联合吉非替尼组能下调MET、ERBB3mRNA，以及MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3蛋白的表达，说明南方红豆杉水提物联合吉非替尼可能在mRNA水平上抑制MET、ERBB3mRNA的表达，并体现在了蛋白的低表达中。南方红豆杉水提物单药能在mRNA水平上抑制MET、ERBB3mRNA的表达，并体现于蛋白的表达中，说明南方红豆杉水提物能够通过抑制MET、ERBB3mRNA的表达抑制HGF/MET通路的激活，实现对抗EGFR-TKIs耐药及抗肿瘤作用。（3）南方红豆杉水提物抑制荷人A549裸鼠移植瘤HGF/MET通路的作用在荷A549裸鼠移植瘤的mRNA表达上，吉非替尼单药组较对照组能够显著上调MET、ERBB3mRNA的表达（P<0.01）。较吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼能显著下调MET的表达（P<0.01），上调ERBB3的表达。而南方红豆杉水提物单药能够显著上调MET、ERBB3mRNA的表达（P<0.01）。在蛋白表达上，吉非替尼单药组能够显著上调MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01）。相较于吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼组能够显著下调荷A549裸鼠移植瘤MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药组较对照组能够显著下调ERBB3的表达（P<0.01），能上调MET、p-MET、p-ERBB3的表达（P<0.01）。由上可见，对A549裸鼠移植瘤，吉非替尼单药能够在mRNA水平上上调MET、ERBB3mRNA的表达，MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的高表达亦证实了这一点，说明吉非替尼可能通过实现了MET、ERBB3基因水平上的扩增。南方红豆杉水提物联合吉非替尼仅能在mRNA水平下调METmRNA，却能在蛋白水平上下调MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达，这说明双药联合能通过抑制HGF/MET通路激活对抗吉非替尼的耐药，其机制可能是抑制MET扩增、MET、ERBB3蛋白的过表达。南方红豆杉单药不能在mRNA水平上实现对MET、ERBB3的调控，也不能实现对发挥作用的p-MET、p-ERBB3蛋白的下调作用。说明南方红豆杉水提物单药对抑制荷A549裸鼠移植瘤HGF/MET通路激活无明显作用。（4）南方红豆杉水提物抑制荷人H1975裸鼠移植瘤HGF/MET通路的作用在荷H1975裸鼠移植瘤的mRNA表达上，吉非替尼单药组较对照组能够显著上调ERBB3mRNA的表达（P<0.01），METmRNA上调无统计学意义。较吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼能显著下调ERBB3mRNA的表达，显著上调METmRNA的表达（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药组的MET、ERBB3mRNARQ值均在统计学意义显著低于对照组（P<0.01）。在蛋白表达上，吉非替尼单药组能够显著上调ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01），下调MET，p-MET的表达（P<0.01）。相较于吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼组能够显著下调荷H1975裸鼠移植瘤p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达（P<0.01），上调MET的表达（P<0.01）。南方红豆杉水提物单药组较对照组亦能够显著下调MET、p-MET、p-ERBB3的表达（P<0.01），上调ERBB3的表达（P<0.01）。综上可见，吉非替尼单药对荷H1975裸鼠移植瘤有上调ERBB3mRNA及其蛋白表达的作用，对MET的基因和蛋白表达均无上调作用。因此吉非替尼对HGF/MET通路无明确激活作用。南方红豆杉水提物联合吉非替尼能够下调ERBB3mRNA的表达，上调METmRNA的表达，并下调荷H1975裸鼠移植瘤p-MET、ERBB3、p-ERBB3的表达，上调MET的表达。H1975作为T790M突变细胞株，其裸鼠移植瘤获得性耐药机制是EGFR的二次突变，南方红豆杉水提物联合吉非替尼虽能对抗吉非替尼耐药，其机制可能不是主要通过抑制HGF/MET通路的激活，而是通过抑制EGFR及其下游信号通路的活化。而南方红豆杉单药能够通过下调MET、ERBB3mRNA，p-MET、ERBB3、p-ERBB3蛋白的表达实现抑制HGF/MET通路的激活，达到抗肿瘤作用。（三）工作展望HGF/MET信号通路的激活在EGFR-TKIs耐药中的作用是近年来非小细胞肺癌研究的重点和热点之一，因为它的激活与EGFR-TKIs的应用密切相关。我们的前期研究已表明南方红豆杉水提物能通过抑制EGFR下游的ERK、STAT3、PI3K/AKT信号通路克服吉非替尼耐药，而这些信号通路同样是HGF/MET通路下游的通路。本实验通过研究南方红豆杉水提物对荷PC9、PC9/R、A549、H1975细胞株裸鼠移植瘤的作用，得到了南方红豆杉水提物能抑制HGF/MET通路的结论。但是，这一结论尚待进一步的实验研究验证，下一步课题组将采用血清药理学的方法，用含药动物血清培养NSCLC细胞系进一步研究HGF/MET通路的作用。我们亦将完善本次实验缺乏阳性对照组的缺憾，采用MET抑制剂作为阳性对照，同时采用不可逆性EGFR-TKI抑制剂作为受试药物之一，用不可逆EGFR-TKIs排除南方红豆杉水提物对EGFR二次突变的影响，更直观、更科学地通过体内外实验明确南方红豆杉水提物对HGF/MET通路的作用。同时，针对南方红豆杉水提物成分尚不明确这一问题，课题组将对其进行成分研究，希望能筛选出有效成分，使南方红豆杉水提物的有效成分更好地应用于临床。总之，南方红豆杉水提物尚待进一步的研究，以阐明其对抗EGFR-TKIs耐药乃至其抗肿瘤的机制。四、小结（一）成功建立了荷PC9、PC9/R、A549、H1975裸鼠移植瘤模型。（二）吉非替尼单药能通过激活HGF/MET通路上调荷PC9/R、A549裸鼠移植瘤p-MET等蛋白表达。（三）较吉非替尼组，南方红豆杉水提物联合吉非替尼组能通过抑制HGF/MET通路下调荷PC9/R、A549裸鼠移植瘤METmRNA、MET、p-MET、ERBB3、p-ERBB3蛋白的表达。（四）南方红豆杉水提物单药能抑制荷PC9、PC9/R、H1975裸鼠HGF/MET通路上MET、ERBB3mRNA，p-MET、p-ERBB3蛋白的表达。结论第一，南方红豆杉水提物联合吉非替尼能通过抑制HGF/MET通路达到对抗荷PC9/R、A549裸鼠移植瘤吉非替尼耐药的作用。第二，南方红豆杉水提物单药通过能抑制荷PC9、PC9/R、H1975裸鼠HGF/MET通路达到抗肿瘤的作用。参考文献[1]MaPC,JagadeeswaranR,JagadeeshSetal.Functionalexpressionandmutationsofc-MetanditstherapeuticinhibitionwithSU11274andsmallinterferingRNAinnon-smallcelllungcancer.CancerRes2005;65:1479–1488.[2]Surveillance,Epidemiology,andEndResults.Table1.1.EstimatedNewCancerCasesandDeathsfor2010.AllRaces,BySex.Availableathttp://seer./csr/1975_2007/results_single/sect_01_table.01.pdf,accessedSeptember4,2012.[3]MolinaJR,YangP,CassiviSD,SchildSE,AdjeiAA.Non-smallcelllungcancer:epidemiology,riskfactors,treatment,andsurvivorship.MayoClinProc,2008,83(5):584-594.[4]SiegelR,MaJ,ZouZ,JemalA.Cancerstatistics,2014.CACancerJClin.2014Jan-Feb;64(1):9-29.[5]XuL,KikuchiE,XuC,EbiH,ErcanDetal.CombinedEGFR/METorEGFR/HSP90inhibitioniseffectiveinthetreatmentoflungcancerscodrivenbymutantEGFRcontainingT790MandMET.CancerRes.2012,72:3302-3311.[6]徐颖扉,张晶,舒琦瑾.南方红豆杉水提物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡与紫杉醇抑瘤机制不同的研究.中华中医药杂志.2012,6(27):1696-1699.[7]鄂尔泰,张廷玉．钦定授时通考.文渊阁四库全书．第732册,台北:台湾商务印书馆股份有限公司,1986:1．[8]江苏新医学院．中药大辞典．上海:上海科技出版社,1995:926．[9]国家中医药管理局．中华本草．第4卷．上海:上海科技出版社,2004:343．[10]李良松,冯仲科,刘德庆.红豆杉名实与功用通考.中国中药杂志.2011,36(12):1682-1685.[11]阮煜,霍锋,张纯,等.红豆杉属植物的化学成分及药理作用研究进展.陕西林业科学,2006,(2):1-5.[12]韩飞飞.红豆杉多糖纯化、结构分析和抗肿瘤活性研究.杭州:浙江大学,2006.[13]SaewanN,KoysomboonS,ChantraprommaK.Anti-tyrosinaseandanti-canc