啤酒中木聚糖的测定

啤酒中木聚糖的测定

近年来，小麦芽被广泛应用于啤酒行业的原料。由于高含量的大型木聚糖不能完全分解，啤酒生产过程中的高含量大米糖无法完全分解，导致低浓度的啤酒提取物、粘度、过滤时间延长、寒冷和浑浊，严重影响了啤酒的生产工艺和品质。木聚糖的基本结构是以(1→4)-β-D-吡喃木糖残基为线性骨干,通过C(O)-2,C(O)-3或C(O)-2,3键联上α-L-阿拉伯呋喃取代物,分子内部广泛交联,形成错综复杂的网状结构。目前尚没有测定木聚糖的标准检测方法,常规的分析测定方法主要有比色法、液相色谱法、气相色谱法。本实验通过对比木聚糖的高效液相色谱法和苯胺比色法进行研究,为啤酒生产企业生产过程中木聚糖的检测提供参考。1材料和方法1.1其它试剂检测木糖对照品纯度≥99.5%;乙腈色谱纯;硫酸、氢氧化钠、苯胺、冰乙酸、超纯水;其它试剂均为分析纯。高效液相色谱仪配示差折光检测器;天平精确到0.001g和0.0001g;真空旋转蒸发器,温控水浴锅,微孔滤膜(0.45μm),紫外分光光度计;pH计。1.2实验方法1.2.1用苯比色法测定木糖1.2.1.黑暗处的保存显色剂的配制:取5mL的苯胺加入到100mL的冰乙酸中,密封,摇匀,置于黑暗处保存。最大吸收峰的扫描:取1mg/mL的木糖标准溶液10mL置于试管中,加入5mL的显色剂,80℃中水浴加热15min,取出待冷却后,进行全波长扫描(200～600nm),蒸馏水做空白,绘制吸光度-浓度标准曲线。1.2.1.标准曲线的绘制准确称取1g木糖标准品,溶解于1000mL的纯水中,配成1g/L木糖标准溶液,再稀释成2、4、6、8、10mg/L木糖标准溶液,取5支试管分别向其中加入1mL标准溶液和5mL显色剂,密封,在80℃中加热10min,取出静置冷却,在480nm处以蒸馏水做空白测定OD值,以浓度做横坐标,OD值做纵坐标绘制标准曲线。1.2.1.木聚糖水分含量的测定取5mL的啤酒超声除气,稀释1倍,加入50mL8%硫酸于100℃水解2h,与显色剂反应,冷却至室温后计算吸光度,按标准曲线直接测定木糖的浓度,将其乘以木聚糖聚合系数0.9为木聚糖的质量。1.2.2采用高效液相色谱法测定了木聚糖含量1.2.2.流动相、柱温、检测色谱柱:键合氨基柱(5μm,4.6×250mm),4.6×250mm,5μm;流动相:乙腈∶水(75∶25,v/v);流速:1.0mL/min;柱温:35℃;检测器:示差检测器,35℃;进样量:10μL。1.2.2.木糖标准溶液的制备分别吸取木糖标准品溶于1L容量瓶中,分别加流动相至刻度,摇匀,用0.45μm微孔滤膜过滤,即得木糖标准溶液系列,分别含木糖1、2、4、6、7mg/L。分别取10μL标准系列溶液进样分析,以木糖浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制木糖的峰面积-浓度标准曲线。1.2.2.ph、硫酸水浴制备啤酒水解后供试品溶液制备:取10mL的啤酒超声除气,置于25mL比色管中,加入4.0mol/LH2SO41mL,摇匀,于水浴80℃水解90min,取出,冷却至室温,加水10mL,加8.0mol/L氢氧化钠溶液中和硫酸(用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L硫酸溶液调pH至5～7),冷却后用纯水定容至刻度。精密量取溶液1mL置于10mL容量瓶中,加流动相定容至刻度,充分混匀后静置3min,用0.45μm微孔滤膜过滤,该溶液为水解后供试品溶液,总稀释体积V1=2500mL。1.2.2.4-样品测试取啤酒水解供试品溶液10μL进行液相色谱分离测定,根据色谱峰保留时间定性,外标峰面积法进行定量。1.2.2.木聚糖含量的计算根据待测供试品色谱峰面积,由标准回归方程式得啤酒样品中木糖含量,将其乘以木聚糖聚合系数0.9为木聚糖含量。供试品中木聚糖含量按下式进行计算。式中:M-啤酒样品中木聚糖含量;C1(g/L)-供试品溶液木糖组分浓度;V1(mL)-供试品溶液水解后的总稀释体积;V0(mL)-啤酒样品的取样体积;0.9-木聚糖聚合系数。2结果与分析2.1测定波长的确定由图1可知,A曲线在波长480nm处和350nm处有最大吸收峰,但由于波长350nm离紫外区比较近,啤酒中其他物质如蛋白,多酚等具有较强吸光度,容易对测定结果产生干扰,而B、C曲线在480nm没有明显吸收峰,可排除背景干扰,所以选择480nm为木糖含量的测定波长。2.2标准比色法中的糖含量以木糖浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,其标准曲线如图2所示,结果显示线性关系较好。2.3糖分离剂的检测如图3所示,其木糖保留时间为7.325min,木糖与木二糖、木三糖、木四糖出峰时间不同,有较好的分离度,能较好地分离检测。图4为啤酒样品的木糖检测结果,计算其出峰面积对照标准曲线可求出木聚糖的含量。2.4标准曲线的分析以木糖浓度为横坐标,以液相检测峰面积为纵坐标,其标准曲线如图5所示,结果显示线性关系较好。计算信噪比为3时所对应的标准溶液的浓度确定检测限,得到最低检测限(LOD)为0.12mg/L。2.5木聚糖加样回收率结果取同一啤酒样品稀释,分为等量3份做平行,分别采用比色法和液相色谱法检测,再分别加入木糖Fig.5Standardcurvexylosebychromatographydetermination标样,计算其加样回收率,结果如表1所示,可以看出用苯胺法测定木聚糖含量时平均回收率为87.85%,色谱法平均回收率为93.36%,色谱法明显高于比色法,初步表明高效液相色谱法测定木聚糖准确性好。2.6分析啤酒样品的结果表2为市售啤酒采用苯胺法和高效液相色谱法检测结果。从表2可以看出,两种方法均有较好的检测效果。3啤酒中木聚糖的检测方法比色法主要通过将啤酒中的木聚糖经过浓酸处理成木单糖,木单糖再与含苯化合物如:间苯三酚,地衣酚,苯胺等反应显色,通过比色法计算木聚糖含量。此法优点在于对仪器设备要求低,能较为快速对木聚糖含量进行测定,适用于半自动化的大规模样品测定,其缺点在于不能对木聚糖中的单糖组成进行精确定量,易受到葡萄糖衍生化物质的干扰。色谱