白藜芦醇类似物的液相平行合成及高通量筛选

白藜芦醇类似物的液相平行合成及高通量筛选博哥（中山大学化学与化学工程学院，广州510275）前言高通量筛选是一种快速、经济的药物筛选方法，药物活性的检测在微孔板中进行，每一个检测仅需要微量的样品，每天可筛选上万个化合物，大大加快了新药发现的速度。高通量筛选技术的进步，对于供试化学样品的需求呈数量级地增长，促进了平行合成技术的发展，加快了化合物合成的速度。根据反应体系的差异，组合合成通常分为固相合成与液相合成，二者各有其优缺点。多羟基苯甲醛席夫碱白藜芦醇有强的抗氧化性，对黑色素的生成具有抑制作用，其衍生物四羟基茋和赤松素不但具有较强的抗菌活性，而且对酪氨酸酶、a-葡萄糖苷酶等均有抑制作用。多羟基苯甲醛席夫碱作为白藜芦醇的类似物，可能对酪氨酸酶、a-葡萄糖苷酶也具有抑制作用。因此，本实验利用芳香醛和芳香胺类化合物的席夫碱反应来合成白藜芦醇类似物，并使用液相平行合成仪合成，然后通过固载清除试剂方法得到比较纯的混合物，最后用酶标仪对所合成的化合物库进行-葡萄糖苷酶抑制活性的初步筛选。多羟基苯甲醛席夫碱白藜芦醇二、实验原理1．多羟基苯甲醛席夫碱的平行合成利用平行合成技术构建化合物库的基本方法主要有以下几种：同步合成法、混合一均分法、液相平行合成法、正交法等。在正交库中，每个化合物要合成两次，且设计每个化合物在两次合成时处于不同的组合之中，通过两个库中活性最高的两个混合物确定活性最高的化合物的结构。本实验将六种不同的醛（Q1-Q6）和六种不同的芳香胺（A1-A6）按表1所示两种方式进行组合合成，这样相当于把36个多羟基苯甲醛席夫碱合成了两次，当把每组混合物用于酶抑制剂筛选后，活性最好的化合物就会形成一个交点。表1多羟基苯甲醛席夫碱的平行合成组合方式胺 醛Q1Q2Q3Q4Q5Q6A1A1Q1A1Q2A1Q3A1Q4A1Q5A1Q6A2A2Q1A2Q2A2Q3A2Q4A2Q5A2Q6A3A3Q1A3Q2A3Q3A3Q4A3Q5A3Q6A4A4Q1A4Q2A4Q3A4Q4A4Q5A4Q6A5A5Q1A5Q2A5Q3A5Q4A5Q5A5Q6A6A5Q1A6Q2A6Q3A6Q4A6Q5A6Q62.酶标仪高通量对a-葡萄糖苷酶抑制活性筛选a-葡萄糖苷酶(a-glucosidase，EC3.2.1.20)是一类能够从含有a-葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解a-葡萄糖基的酶的总称、包括麦芽糖酶(a-D-glucosidaseglucohydrolaseEC3.2.1.20)、异麦芽糖酶(dextrin6-a-D-glucanchydolase，EC3.2.1.10)、蔗糖酶(sucrase，a-D-glucohydrolase，EC3.2.1.48)和海藻糖酶(trehalase，a-trehalaseglucohydrolase，EC3.2.1.28)等，这些酶首先从猪肠粘膜中分离得到，随后从人体组织中也制备得到，又叫a-D-葡萄糖苷水解酶。对于测试a-葡萄糖苷酶的方法，目前已经比较成熟，但是在不同的文献中，测试条件还是略有不同。一般采用对硝基苯酚a--吡喃葡萄糖苷为底物，经过酶催化水解后产生对硝基苯酚，后者在中性及碱性溶液中400-410nm有较强的光吸收，随着反应时间的延长，光吸收越强，在紫外-可见分光光度计上呈现出一条上升的直线。三、仪器试剂仪器Heidolph液相平行合成仪、96孔板、酶标仪、移液器。试剂醛类化合物六种：间羟基苯甲醛(Q1)、2,4-二羟基苯甲醛(Q2)、对羟基苯甲醛(Q3)、3-羟基-4-甲氧基苯甲醛(Q4)、3-甲氧基苯甲醛(Q5)、4-甲氧基苯甲醛(Q6)；芳香胺类化合物六种：对甲氧基苯胺(A1)、2,4-二甲氧基苯胺(A2)、2-氨基-4-硝基苯酚(A3)、2-氨基5-硝基苯酚(A4)、3-氨基苯甲酰胺(A5)、4-氨基苯甲酰胺(A6)；其他试剂：无水Na2SO4、阳离子交换树脂、乙酸乙酯、无水乙醇、无水Mg2SO4、赖氨酸-氢氧化钠水溶液，DMSO，a-葡萄糖苷酶，对硝基苯酚葡萄糖糖苷，磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH=6.80)操作步骤1．多羟基苯甲醛席夫碱的平行合成在六个每个反应管中加入六种醛类化合物(50mmol/m1)的乙醇溶液(各0.5ml),分别加50mmol/ml的一种芳香胺6.0ml和0.05mmol的无水Na2SO4(7.1mg)做吸水剂，回流2-3小时。反应结束后，将仪器改为浓缩装置，蒸出乙醇。余下的固体物用1-2ml乙酸乙酯溶解，加入5g阳离子交换树脂，混合均匀后，放置30-60分钟；过滤，用乙酸乙酯洗涤后，蒸出乙酸乙酯，余下的产物溶解在5-6ml乙醇或DMSO中，用于筛选。在另外六个反应管内加入六种芳香胺类化合物(50mmol/ml)的乙醇溶液(各0.5ml)，分别加50mmol/ml的一种醛类化合物6.0ml和0.05mmol的无水Mg2SO4(7.1mg)做吸水剂，回流2-3小时。反应结束后，蒸出乙醇，再加入5mmol/ml的赖氨酸-氢氧化钠水溶液6ml，1-2ml乙醇，继续回流30分钟，使过量的醛类化合物与赖氨酸反应，水溶液部分用乙酸乙酯萃取，除去乙酸乙酯后即可达到纯的化合物，用5-6ml乙醇或DMSO中，用于筛选。2.酶标仪高通量对a-葡萄糖昔酶抑制活性筛选根据我们合成的90多种希夫碱对a-葡萄糖苷酶酶抑制活性结果，大多数抑制活性的IC50在10-100ymol/L，部分希夫碱的IC50低于10ymol/L。如果本实验中，每一个反应系统中的转化率都能保证为100%，配成5ml溶液那么，最终的样品量为30卩mol/ml,利用酶标仪测试，总体积为200yl，取10ml样品溶液，那么最后的样品总浓度可达1500ymol/L，每一种样品的浓度为250卩mol/L。取96孔酶标板或培养板一块，按表在孔中加入稀释后的a-葡萄糖苷酶酶液10口，样品10口,每孔总体积为200yl，DMSO10pl,浓度保持在5%，然后对硝基苯酚葡萄糖糖苷(pNPG)溶液(1.00mg/mL)10pl,酶标仪上405nm上立即测定，2分钟后再测一次，根据两次测定的结果计算酶催化反应速率，再计算抑制率。五、结果分析与讨论

1．数据记录表2起始OD值数据123456789101112A-0.346-0.347-0.076-0.0640.0520.0620.2050.0140.0720.374-0.358-0.360B0.7320.8852.8642.9870.4660.5650.2951.4540.6530.7690.7500.695C0.2820.4161.9272.7560.3010.3990.0841.0390.2750.5500.3910.522D0.0210.1050.9581.5310.0860.193-0.0290.3320.0870.3470.1840.422E-0.127-0.0040.4200.6470.0280.102-0.0830.1450.0120.0830.227-0.034F-0.146-0.1010.1310.227-0.003-0.287-0.0300.0830.0050.1100.0650.065G-0.188-0.116-0.0270.015-0.0220.141-0.0010.1030.4850.2450.1810.304H-0.227-0.119-0.019-0.003-0.0350.1900.0920.1440.4270.2460.2600.460表32minOD值数据123456789101112A-0.815-0.8160.0600.047-0.0940.1160.3670.2610.2480.52-0.828-0.829B0.7820.9252.5242.5300.3680.577-0.0771.4130.4630.6850.6640.611C0.3410.5381.6072.2180.3180.454-0.2431.0340.1820.5170.4130.482D0.1200.1800.7791.1870.0460.260-0.3040.3430.0720.3080.1580.320E-0.1410.0690.3310.3430.0700.111-0.2840.138-0.0090.0690.121-0.106F0.039-0.0270.0950.1650.008-0.379-0.1310.091-0.0210.050-0.072-0.058G-0.0670.010-0.072-0.129-0.0140.2120.0060.2100.6070.2700.2140.298H-0.2560.0240.0790.059-0.0440.3180.0640.2320.5700.2370.2040.3922．数据处理（1）酶催化反应速率酶催化反应速率=（终止时间OD值-起始时间OD值）/反应时间，根据表2、表3中数据可得不同浓度，不同样品的酶催化反应速率如表4所示。表4酶催化反应速率123456789101112A-0.235-0.2350.0680.056-0.0730.0270.0810.1240.0880.073-0.235-0.235B0.0250.020-0.170-0.229-0.0490.006-0.186-0.021-0.095-0.042-0.043-0.042C0.0300.061-0.160-0.2690.0090.028-0.164-0.002-0.047-0.0170.011-0.020D0.0500.038-0.090-0.172-0.0200.034-0.1380.006-0.008-0.020-0.013-0.051E-0.0070.037-0.045-0.1520.0210.005-0.101-0.003-0.011-0.007-0.053-0.036F0.0930.037-0.018-0.0310.006-0.046-0.0510.004-0.013-0.030-0.069-0.062G0.0610.063-0.023-0.0720.0040.0360.0040.0540.0610.0130.017-0.003H-0.0150.0720.0490.031-0.0050.064-0.0140.0440.072-0.005-0.028-0.034（2）IC50根据实验结果，计算出加入不同浓度样品后的酶活力为相对活力百分数 （即残余活力百分数），将相对活力与样品浓度（卿ol/L）作图，从图上找出酶相对活性为50%时，样品的浓度,

即为IC50值。计算公式如下：a.活性100%时的数据=无抑制孔数值-缓冲液孔数值va%=fx100(%)vva%=fx100(%)v0C.相对活力计算：V为样品的抑制数据，V为样品的抑制数据表4酶相对活性与样品浓度关系总浓度/ymol•L-1A2/%A3/%A4/%A5%A6/%75087.54285.85921.8862.18962.62681.14537589.05799.66325.253-11.44881.98788.384187.595.79191.75148.99021.21272.39190.40493.7576.76891.41464.14127.94686.19580.64046.875110.26991.58273.06468.68780.97663.63623.437599.495100.33771.54954.88280.47191.07711.7187574.242103.19995.62389.56277.609100.673总浓度Q1/%Q3/%r\A//77,CUE/ymol•L-1Q2/%Q4/%Q5/%Q6/%75016.49872.22247.13864.98364.64664.98337524.07478.28363.46873.56982.82872.391187.532.82880.97676.59972.55974.74761.95393.7545.28677.94675.58976.76861.27967.00346.87562.12180.47174.74769.02456.06158.41823.437580.30397.13899.66383.33384.68078.11411.7187574.41193.939103.19977.60969.69767.677表5阳性对照浓度/卩mol•L-112562.531.2515.6257.81253.90625酶相对活性/%54.54588.215106.397120.707108.754103.704从数据上分析，A1、A2、A5、A6、Q2、Q4、Q5、Q6、阳性对照由于酶的相对活性在样品最高浓度下仍大于50%，所以无法找出IC50，若要找出IC50值应对样品进一步稀释。将A3、A4、Q1、Q3酶相对活性与样品浓度关系做图，如图1所示，并由图中找出IC50值，列于表6。表6IC50值样品IC50/pmol•L-1样品IC50/pmol•L-1A1>750Q176.4A2>750Q2>750A3136.8Q3673.3A432.7Q4>750A5>750Q5>750A6>750Q6>750

(3)酶抑制率酶抑制率=1-(系列样品酶催化速率/无抑制溶液酶催化速率)，计算结果如表5所示。4022652「22L-1■1「64阳性对照 (3)酶抑制率酶抑制率=1-(系列样品酶催化速率/无抑制溶液酶催化速率)，计算结果如表5所示。4022652「22L-1■1「64阳性对照 >12566123456789101112A0.9980.998-0.0200.0220.4550.118-0.064-0.207-0.088-0.0371.0000.998B0.1250.1410.7810.9780.3740.1890.8350.2780.5290.3500.3540.350C0.1090.0030.7471.1140.1800.1160.7590.2170.3650.2640.1720.276D0.0420.0820.5100.7880.2760.0960.6720.1900.2340.2740.2530.380E0.2320.0860.3590.7210.1380.1940.5470.2210.2440.2320.3870.330F-0.1030.0840.2690.3130.1900.3640.3790.1950.2530.3100.4390.416G0.005-0.0030.2850.4510.1950.0890.1970.0290.0030.1670.1530.219H0.258-0.0320.0440.1040.224-0.0070.2560.061-0.0320.2240.3030.3233．讨论根据讲义，大多数希夫碱对a-葡萄糖苷酶酶抑制活性的IC50在10-100卩mol/L之间，而本实验，从各个组合IC50值可以看出，大多数组合的IC50值偏高（总浓度＞750mol/L，每种席夫碱＞125mol/L）o这可能由以下原因造成：（1）每一个反应系统中的转化率都不能保证为100%,导致样品的实际浓度偏