蛋白纯化讲座

蛋白纯化的基本原理和应用广东省微生物所重点实验室莫翠云主要内容蛋白质的特点及研究价值生物大分子分离方法概述蛋白分离纯化的一般原则蛋白分离纯化的色谱技术蛋白质的特点及研究价值没有蛋白质就没有生命，蛋白质是生物体中含量最高、功能最重要的生物大分子。20多种氨基酸可以组成人体内的10万余种蛋白质分子。高纯度的蛋白质对研究未知蛋白的分子结构、性质和生物活性有着重要价值。生物工程工艺流程中，下游工程的投入常常超过总投入60％。干扰素售价高达1千万/克，80％的成本用在难度大、费用高的分离纯化上。生物大分子分离方法概述传统方法：沉淀、透析、超滤和溶剂萃取等。现代分离技术：毛细管电泳、色谱（理论塔板数可达百万数量级）。但毛细管电泳不能用于生产规模的生物大分子的分离纯化，而在生物技术制取蛋白质的多级纯化过程中，液相色谱被指定为一个“必需步骤”，成为实验室和工业生产上分离纯化及制备生物大分子最常用和有效的方法。蛋白质分离纯化的一般原则基本原则：从复杂的多组分物质中将目标组分分离，尽可能多的获得具有生物学活性的蛋白和多肽产物，并增加目标产物的纯度和比活性，必须避免目标蛋白和多肽的变性及降解。了解和牢固掌握：目标蛋白的物理化学、生物学特性以选择合适的单元操作，其中包括选材、提取纯化目标蛋白及后续的定性定量鉴定。蛋白质分离纯化的一般步骤目标蛋白的释放：选材合适，使目标蛋白尽可能维持天然构象状态下释放。动物组织（电动搅碎或匀浆处理），带细胞壁的细菌和植物细胞（超声波、研磨、酶法消化、低温冰冻等）。初步纯化：蛋白质溶液选择适当的纯化操作使目标蛋白与杂质分离，在保持活性的前提下使产物浓度及质量有明显提高。高度纯化（精细纯化）：主要采用色谱技术，如离子交换、亲和、分子排阻、疏水等。具高度选择性，可去除物化性质相近的杂质。蛋白质分离纯化的一般步骤成品的加工：浓缩、结晶和冷冻干燥（保持天然活性）。相应的鉴定：纯度可用电泳、色谱等方法；相应的活性鉴定方法，其他方法。蛋白质分离纯化的色谱技术按分离机制可划分为：吸附色谱分离法、共价作用色谱分离法、凝胶过滤色谱分离法、分配色谱分离法。蛋白质分离纯化的色谱技术——凝胶排阻色谱（1）定义：又称分子排阻、分子筛色谱等。根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。介质：大分子惰性聚合物（如交联葡聚糖）。流出顺序：大分子先出，小分子后出。优点：设备简单易操作，不需梯度泵；根据已知组分可推算未知组分尺寸大小；色谱柱寿命长。蛋白质分离纯化的色谱技术——凝胶排阻色谱（2）应用范围：对抗原抗体的分离纯化；去除混合组分中的小分子物质，如脱盐及水解的蛋白质碎片等；与其他手段联用分析分离免疫复合物及分子量大小和分子量在混合物中的分布。蛋白质分离纯化的色谱技术——凝胶排阻色谱（3）缺点：分离度较低，色谱峰容量小，样品单次处理量很小。上样量一般为柱床体积的0.5％-4.0％，要想得到最大分辨率则不可超过柱床体积的2.0％。影响因素多：柱子直径、填料填充密度、洗脱流速、样品和缓冲液的粘稠度等因素都极大的影响分辨率、回收率及分离时间。蛋白质分离纯化的色谱技术——疏水作用层析（1）原理：根据蛋白表面疏水性差异进行纯化，要求蛋白质分子表面的疏水区暴露，因此需要通过盐析（如加入硫酸胺）。可通过调整样品溶液pH值至蛋白pI附近从而使蛋白吸附达到最大量。洗脱方式：可通过降低缓冲液离子强度或增加pH值来增加蛋白质亲水性等。蛋白质分离纯化的色谱技术——疏水作用层析（2）技术关键：选择合适的配基结构，摸索阶段优先选择中等结合力介质。优点：可作为离子交换纯化的下一步操作，这样疏水作用层析在高盐下上样吸附蛋白，不需离子交换层析产物换液，即达到纯化蛋白又达到换液的目的，节约时间，减少蛋白的损失。蛋白质分离纯化的色谱技术——亲和层析（1）分离原理：利用蛋白质对层析介质上的配体特异专一识别，通过生物学亲和力可逆的结合。例如纯化酶时配体可以是底物、可逆抑制剂、相对应的竞争性抑制剂或别构效应物；利用已经制备好的固相抗体（或抗原）纯化相应抗原（或抗体）等建立起高分辨纯化方法。蛋白质分离纯化的色谱技术——亲和层析（2）注意事项：在纯化蛋白质时，介质上的单抗与待分离目标蛋白结合力很强，需要较为苛刻的洗脱条件，这样会使蛋白失活并破坏单抗；同时混合物中蛋白酶也可能破坏抗体或与之非特异性结合；一些单抗也会在纯化过程中解离下来混入目标产物，因此要从最终产物中去除。工艺中位置：最后使用，经前面单元操作处理后样品体积减少，大部分杂质已去除，减少了亲和层析的压力。蛋白质分离纯化的色谱技术——亲和层析（3）应用：大规模应用在酶制剂、抗体等的分离精制，核酸；小规模应用在核酸、免疫球蛋白、膜受体、核苷酸、细胞器甚至完整细胞的纯