克唑替尼治疗实体瘤me靶点的研究进展

克唑替尼治疗实体瘤me靶点的研究进展

1反应前后抗混合物的细胞系统状况研究1：zouh，liq。你的日常研究中没有c-met、pf-23466、c-met和其他微囊动物[j]。康齐，2007，67（9）：448-4417。研究二:TanizakiJ,OkamotoI.METtyrosinekinaseinhibitorCrizotinib(PF-02341066)showsdifferentialantitumoreffectsinnon-smallcelllungcanceraccordingtoMETalterations[J].JThoracOncol,2011,6(10):1624-1631.2证据水平5。3met抑制剂研究一:近年来,大量研究显示很多人类恶性肿瘤与肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)/MET信号通路的异常调节相关,针对HGF/MET的靶点抑制剂成为实体瘤靶向治疗领域的热点。克唑替尼(Crizotinib,PF-02341066)是一种强效、口服ATP竞争性小分子MET激酶抑制剂,可以作为MET依赖的实体瘤治疗的新靶向药物。研究二:针对MET靶点的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor,TKI)已经进入实体瘤的临床试验阶段,但预测MET-TKI疗效的生物标志物仍未明确。寻找克唑替尼针对MET的作用靶点,可以帮助临床选择最佳获益患者,真正实现靶向药物的精准治疗。4克唑替尼met靶点临床应用的理论背景研究一:通过体内外实验明确克唑替尼的药理学特性、抗肿瘤效应和生物学安全性,从而为克唑替尼针对MET靶点的临床应用提供理论背景。研究二:在MET扩增、突变和野生型的肺癌细胞株上分别验证克唑替尼的抗肿瘤效应,寻找其抑制MET受体酪氨酸激酶的作用靶点。5药物作用机制誗研究一的细胞体外实验和动物体内实验流程见图1和图2。誗研究二:(1)细胞体外实验:克唑替尼处理MET扩增、突变、野生型肺癌细胞株,寻找药物抑制各类细胞生长的IC50值,同时研究药物处理后下游信号分子的变化,流程见图3。(2)克唑替尼对MET扩增肺癌细胞株的抑制作用及其作用机制验证:誗METsiRNA分别转染MET扩增和突变的肺癌细胞株;誗BIM上调和Survivin下调的功能验证:在MET扩增肺癌细胞株中分别转染BIMsiRNA、Survivin表达载体。(3)克唑替尼动物体内抗肿瘤实验流程见图4。6met磷酸化的抑制效果研究一:(1)细胞体外实验克唑替尼抑制肿瘤细胞作用的IC50值见表1。(2)动物体内实验给MET依赖的移植瘤小鼠口服不同剂量的克唑替尼[3.125mg/(kg·d),6.25mg/(kg·d),12.5mg/(kg·d),25mg/(kg·d),50mg/(kg·d)]来检测其体内抗肿瘤的疗效。50mg/(kg·d)剂量时,抑制100%肿瘤生长对应MET磷酸化的完全抑制;12.5mg/(kg·d)剂量时,抑制60%肿瘤生长对应80%~90%(1~8h)的MET磷酸化抑制,在16~24h后降低到50%~60%;6.25mg/(kg·d)剂量时,没有显著的肿瘤生长抑制作用,在1~8h时抑制MET磷酸化30%~50%。研究二:(1)细胞体外实验:克唑替尼能明显抑制MET扩增阳性细胞的生长,见表2。(2)克唑替尼显著降低MET扩增阳性细胞下游信号分子p-AKT、p-ERK表达水平。(3)克唑替尼引起MET扩增阳性细胞的大量凋亡,而MET扩增阴性细胞不受影响。(4)转染METsiRNA,MET扩增阳性细胞下游信号分子p-AKT、p-ERK表达水平显著降低,而MET突变细胞下游信号分子不受影响。(5)克唑替尼引起MET扩增阳性细胞凋亡依靠BIM的上调和Survivin的下调。(6)动物体内抗瘤实验。种植EBC-1细胞(MET扩增阳性)的成瘤鼠,25mg/(kg·d)、50mg/(kg·d)剂量处理,均可引起肿瘤体积缩小,药物未引起明显毒副反应和体重减轻。种植H1437细胞(MET突变)和A549细胞(MET野生型)的成瘤鼠,50mg/(kg·d)剂量处理也未见肿瘤体积缩小。7克唑替尼主要作用于小鼠肿瘤血管生成研究一:克唑替尼可以直接抑制MET依赖的肿瘤细胞的生长,还可以抑制肿瘤血管生成;克唑替尼作用于MET依赖的移植瘤小鼠,有良好的抗肿瘤疗效。研究二:克唑替尼能显著抑制MET扩增的肺癌细胞生长,但是对MET扩增阴性即使有MET突变的肿瘤细胞也无抑制作用。8克唑替尼抑制met磷酸化的机制晚期非小细胞肺癌的治疗已进入个体化靶向治疗时代。针对MET的靶向抑制治疗是目前肺癌个体化诊疗的新热点。MET的小分子抑制剂,如SU11274和PHA-665752,虽然在体外和体内研究中有明确的抗癌作用,但是由于药学特性和口服用药的生物利用度差,临床应用受限。目前研究认为新型小分子MET抑制剂克唑替尼、AMG337、INC280具有良好的临床耐受性,开启了针对MET信号通路的小分子抑制剂的新纪元。文献一发现在体外研究中,克唑替尼对MET酪氨酸激酶有很强的选择性抑制作用,可抑制多种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,且有效地抑制HGF刺激的内皮细胞的生长、侵袭和血清诱发的血管形成。为探讨MET基因不同位点的点突变是否会影响克唑替尼对MET酪氨酸激酶活性的抑制效果,作者采用ELISA方法,发现克唑替尼对存在ATP结合区、P-环区和近膜区MET基因突变细胞的MET磷酸化的抑制作用与野生型相似或有增强,而对包含活化环区的Y1230C和Y1235D突变的细胞对比野生型细胞的抑制率显著降低。作者进一步验证克唑替尼对裸鼠皮下移植瘤成瘤能力的影响,发现克唑替尼能显著抑制因MET基因扩增,或同时自分泌HGF和表达MET导致的MET呈激活状态的肿瘤细胞所建立的移植瘤的生长,其抑制效果与MET磷酸化的抑制程度直接相关。在存在旁分泌HGF(间质细胞产生)条件下,克唑替尼亦可抑制无MET基因扩增和不能自分泌HGF的NCI-H441肺腺癌细胞建立的移植瘤的生长。但是同样的条件下,对无MET基因扩增和不能自分泌HGF的MDA-MB-231乳腺癌细胞和DLD-1直肠癌细胞,克唑替尼并不能有效抑制肿瘤的生长,其中的分子机制未明确。文献二以MET基因扩增的非小细胞细胞株EBC-1和H1993、MET基因突变的H2122、H1437和H596细胞株、EGFR基因突变的PC9和HCC827细胞株以及无基因扩增或突变的A549和H1299细胞株为研究对象。作者发现克唑替尼可显著抑制MET基因扩增非小细胞肺癌细胞的增殖、诱导凋亡和抑制体内移植瘤的生长。但是,克唑替尼对配体结合区和膜旁区MET基因点突变的细胞、EGFR突变细胞、无MET基因扩增和突变的细胞均无明显抑制作用。我们可以看到两文献均为最早探索小分子MET酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼对恶性肿瘤细胞作用的临床前研究佳作,从原癌基因MET在多种恶性肿瘤中异常激活的临床现象出发,提出假说,通过多种技术手段,从不同的研究层面探讨了克唑替尼的抑癌作用。两篇文献均提示克唑替尼对MET基因扩增的恶性肿瘤细胞有显著的抑制作用。Okamoto等在胃癌中也证实了这一结论。文献一又从内皮细胞角度发现了克唑替尼的抗血管生成功能。还从HGF角度发现,HGF是MET目前已知的唯一配体,HGF通过与MET结合,进而活化MET,从而发挥一系列生物学特性。从配体角度出发,发现自分泌HGF或旁分泌HGF的恶性肿瘤细胞对克唑替尼有不同的反应。此外,两篇文献都对MET基因点突变是否影响克唑替尼的效果进行了探讨,但是,两篇文献关注角度不同,文献一是从影响MET酪氨酸激酶磷酸化的角度,文献二是从细胞增殖、凋亡等功能学的角度,两个角度有各自的侧重点和说服力。两篇文献对所涉及的问题从多角度、多层面进行细致入微的分析,反复验证,严谨周到,值得我们借鉴和学习。虽然还有复杂的分子机制尚未明确,相信遵循这种研究方法,不久的将来能进一步明确其分子机制。两篇文献对MET抑制剂用于存在MET基因扩增的晚期肺癌的治疗提供了理论和实验依据,提示其潜在的临床应用前景。此后,在Ou等的研究中报道了1例MET基因扩增的非小细胞肺癌患者,无间变淋巴瘤激酶(ALK)基因的重排,口服克唑替尼治疗效果迅速且持久,服用1周时症状明显缓解,8周时(按照RECIST标准)病灶缩小45.2%,11个月缩小54.8%。副作用轻,表现为Ⅰ级无症状窦性心动过缓和Ⅰ级视力障碍。Ou等的研究为两篇文献提供了临床验证支持。2014年ASCO上报道了克唑替尼治疗MET扩增晚期非小细胞肺癌的疗效和安全性的Ⅰ期试验(NCT00585195),该研究结果显示在高、中度MET扩增患者,克唑替尼的有效率为41.7%。目前,克唑替尼用于MET异常表达的恶性肿瘤患者已进入Ⅱ期临床试验(NCT02034981)。MET基因扩增在非小细胞肺癌中约仅占5%,能否发现更多预测MET抑制剂有效性的分子标记以及能否进一步提高克唑替尼的临床效果,我们期待更多的深入研究数据。此外,Engelman等发现约20.9%的吉非替尼继发耐药非小细胞肺癌组织中可检测到MET