曼陀罗种子休眠机理及破眠方法研究

曼陀罗种子休眠机理及破眠方法研究

曼陀罗是茄子科的一种植物。它的花、叶和种子可以单独药物。它的味道很热。它具有哮喘、止咳、解痉、镇痛、麻醉等功效。曼陀罗的主要活性成分为莨菪碱、东莨菪碱和阿托品,其在临床上用于多种疾病的治疗。曼陀罗还有杀鼠、杀虫、杀菌、除草等农用生物活性,在植保领域具有广阔的开发利用前景。曼陀罗用种子繁殖,但其种子存在显著的休眠性,且有发芽率低、出苗不整齐等特性,给其研究和生产带来了困难。国内外对曼陀罗种子休眠机理与破眠方法的系统研究还未见报道,本试验对曼陀罗种子休眠机理进行研究,并利用物理、化学方法处理曼陀罗种子,以打破其种子休眠,提高种子发芽率,为曼陀罗种质资源保护及人工种植提供科学依据。1材料和方法1.1曼陀罗种子的采集供试曼陀罗种子于2009年9月采自西北农林科技大学校园生长的野生曼陀罗。果实成熟到果皮开裂时采摘,取出种子,室内晾干备用。本文提及的新采收曼陀罗种子指采收后晾干了1周的种子。1.2方法1.2.1营养组织胚乳的染色用TTC法测定新采收的曼陀罗种子生活力:室温浸种24h后剥去种皮纵切种仁(胚乳和胚的总称),用0.5%TTC溶液于30℃黑暗条件下显色12h,统计显色结果,胚的主要结构以及营养组织(胚乳)染成有光泽的鲜红色且组织状态正常的为有活力的种子;胚的主要结构局部染色或营养组织不染色、组织软化的为不正常种子;完全不染色或染成淡红或灰白色、组织异常、腐烂的为死亡种子。试验重复4次,每重复50粒种子。计算公式:种子生活力百分比=(有活力的种子数/供试种子数)×100%发芽试验:发芽床为铺有滤纸培养皿,25℃黑暗培养,第7天和第15天时分别统计发芽的种子数,每皿50粒种子,4次重复。计算公式:发芽势=(第7天时发芽的种子数/供试种子数)×100%发芽率=(第15天时发芽的种子数/供试种子数)×100%1.2.2种子表面水分(2)种皮透水性测定参照杨文权的方法测定种子吸水率:取曼陀罗种子2份,各100粒,一份不经任何处理,另一份经10%NaOH溶液腐蚀种皮90min,分别放入50mL小烧杯中,加蒸馏水浸泡,于1、3、6、12、18、24、36、48、72h取出种子,用吸水纸吸干种子表面水分,称重,试验重复3次。吸水率计算公式:吸水率=[(浸种后重量-浸种前重量)/浸种前重量]×100%(3)种皮透气性测定取曼陀罗种子,参照王贵余的方法,用0.05%~1%H2O2于室温浸种12h,使种皮受到轻度腐蚀,用清水冲洗后进行发芽试验,对照为蒸馏水浸种12h。1.2.3发芽试验方法(2)GA3浸种将采收1周后的曼陀罗种子去皮后分别用50、100、150、200、250、300mg/L的GA3溶液浸泡24h,以蒸馏水浸种作为对照,进行发芽试验,方法同1.2.3.(1)。1.2.4曼不同充填的制备(1)萌发抑制物的提取与生物测定取新采收的曼陀罗种子,参照赵敏的方法,用蒸馏水分别提取其种皮、种仁的抑制物,以蒸馏水作为对照,用白菜种子进行生物测定,48h时统计发芽率、测量幼苗根长、称量幼苗鲜重。每皿100粒,3次重复。内源物抑制率计算公式:抑制率=(1-处理/对照)×100%(2)内源抑制物的原位作用参照周艳玲的方法,取5支试管编号,1、2、3号试管分别放入50粒曼陀罗种仁,4、5号试管分别放入50粒曼陀罗种子的种皮,各加10mL蒸馏水浸泡24h。处理1:将1号试管中浸泡过的种仁取出,取1号试管中6mL种仁浸泡液进行培养;处理2:将2号试管中浸泡过的种仁取出,用6mL蒸馏水进行培养;处理3:从3号试管中取出6mL种仁浸泡液,用以培养未浸泡过的干种仁;处理4:将3号试管中浸泡过的种仁取出,取4号试管中6mL种皮浸泡液进行培养;处理5:从5号试管中取出6mL种皮浸泡液,用以培养未浸泡过的干种仁;处理6(对照):取未浸泡过的干种仁,加6mL蒸馏水进行培养。处理后进行发芽试验,方法同1.2.3.(1)。1.2.5种子处理与发芽试验取已经过了生理休眠期的曼陀罗种子(储存6个月后),进行如下处理:(1)物理法:A.机械摩擦:将种子加细沙磨至种子表面失去光泽。B.干湿交错:将种子先用蒸馏水浸泡24h,再置于30℃烘箱中烘24h,如此反复进行3次。以不做任何处理的种子作为对照,进行发芽试验。(2)化学法:A.H2SO4腐蚀种皮:将种子用浓H2SO4分别浸泡5、10、20、30、40、60min。B.NaOH腐蚀种皮:将种子用5%、10%、20%、30%NaOH溶液分别浸泡30、60、90、120、150min。处理后彻底冲洗干净,以不做任何处理的种子作为对照,进行发芽试验。1.3处理数据数据用MicrosoftExcel及SPSS12.0软件进行统计分析。2结果与分析2.1曼不同种子生活力种子生活力是种子发芽的潜在能力或胚具有的生命力,具有生活力的种子不一定都具有发芽力,如果种子生活力显著大于种子发芽率,说明种子处于休眠状态。表1显示,供试的4组种子仅4粒为不正常或死亡种子,经计算曼陀罗种子生活力百分比为98%。由表2可以看出,曼陀罗种子发芽势为0,发芽率为6%,种子生活力远大于发芽率,说明新采收的曼陀罗种子存在显著的休眠现象。2.2曼陀罗种子发芽的繁殖障碍2.2.1发芽势、发芽率由图1可以看出,新采收的曼陀罗种子经机械摩擦和剥除种皮后均可极显著提高种子的发芽势、发芽率(P<0.01);机械摩擦和剥除种皮后,种子的发芽率分别为32.5%和58.5%,而对照的发芽率只有6%,说明种皮障碍是曼陀罗种子休眠的重要原因。2.2.2种子的吸水性由图2可以看出,未经处理的曼陀罗种子在1h内吸水最快,之后吸水速率逐步降低,24h时吸水速率趋于平稳;经10%NaOH溶液处理90min后的种子在1h内吸水最快,之后吸水速率也趋于平稳。1h时,对照种子吸水率只有31.3%,而经10%NaOH溶液处理的种子吸水率达69.45%,说明曼陀罗种皮透水性差,用NaOH腐蚀种皮,可以提高种子的吸水率,从而促进种子萌发。2.2.3曼不同皮的透气性由图3可以看出,曼陀罗种子用0.25%H2O2浸种后,种子的发芽势比对照显著提高(P<0.05)、发芽率比对照极显著提高(P<0.01),说明曼陀罗种皮透气性比较差。因为用H2O2处理种子,可使种皮受到轻度腐蚀,增强种皮的透气性。2.3曼陀罗工厂的休息机制2.3.1曼不同储藏时期发芽率的变化由图4可以看出,新采收的剥除了种皮的曼陀罗种子发芽势为7.5%、发芽率为42.0%,其储藏4个月和6个月时,发芽率分别达到73.5%和87%。依据文献报道种子自然发芽率在80%以下的时期为种子休眠期,故推测出曼陀罗种仁休眠期为6个月;储藏8个月时发芽率达到93.0%,接近其种子生活力,种仁休眠解除。可见,曼陀罗种仁自然休眠期为6~8个月,随着储存时间延长,即曼陀罗种子休眠原因主要是种皮障碍。2.3.2外源ga3对曼不同种子发芽率的影响由图5可以看出,采收1周的曼陀罗种子(剥除种皮)用50mg/L到300mg/L的GA3溶液处理,发芽势、发芽率均比对照极显著提高(P<0.01)。GA3浓度为200mg/L时,曼陀罗种子的发芽率达91.5%,可见用外源GA3浸种,可打破曼陀罗种子生理休眠,提高种子发芽率。同时也说明曼陀罗新种子中缺少种子萌发的相关激素GA3。2.4曼陀罗种子发芽抑制2.4.1子发芽率、幼苗根长、鲜重的抑制作用由表3可以看出,曼陀罗种皮、种仁水提液对白菜种子发芽率、幼苗根长及鲜重均有抑制作用,且随着浓度的提高抑制作用增强,种仁的抑制活性大于种皮。由此可知,曼陀罗种皮、种仁中均存在水溶性萌发抑制物。2.4.2#ck比由图6可以看出,曼陀罗种子不同处理的发芽势、发芽率、幼苗根长的大小顺序均分别为:3<CK<1<2、5<CK<4<2、3<5(1)<(4)CK<4。以上结果说明,曼陀罗种仁和种皮中均含有内源萌发抑制物,而且曼陀罗种仁中萌发抑制物的活性大于种皮。2.5物理和化学法的睡眠效果2.5.1干旱交错处理发芽势和发芽率变化由表4可以看出,曼陀罗种子用机械摩擦处理后,发芽势、发芽率均比对照极显著提高(P<0.01),发芽势比对照提高33.5%,发芽率比对照提高48%。干湿交错处理后,发芽势与对照差异不显著,发芽率与对照差异极显著(P<0.01),发芽率比对照提高5%。因为种皮障碍是曼陀罗种子萌发的主要限制因素,所以用机械摩擦处理可以打破曼陀罗种子休眠。2.5.2发芽势、发芽率的变化由图7可以看出,曼陀罗种子用浓H2SO4处理不同时间后的发芽势、发芽率先升高后降低。处理30min时的发芽势、发芽率最高,均与对照差异极显著(P<0.01),发芽势达15%,比对照提高11%;发芽率达23%,比对照提高15%。可见用浓H2SO4处理30min在一定程度上可以使曼陀罗种皮障碍解除而打破其种子休眠。2.5.3naoh处理3讨论3.1曼陀罗种仁休醉期的确定本研究结果表明,去除种皮的曼陀罗新采收的种子自然休眠期为6~8个月,这个时间段休眠有其重要的生物学意义。曼陀罗为一年生植物,每年4~5月开始出苗,9~10月果实成熟,从其果实成熟到来年发芽正好6~8个月时间,这个时间段长度与我们测试得出的曼陀罗种仁休眠期刚好吻合,这有利于曼陀罗度过冬季不适宜生长季节,更好地保证来年种子在适宜生长条件下萌发,成功繁衍后代。由于曼陀罗种子成熟期不一致,导致所测新种子种仁休眠期表现为6~8月,而不是整齐一致时间。3.2抑制剂作用机理种皮障碍是限制曼陀罗种子萌发的首要因素。透性机理认为种子的休眠程度与种皮的不透性或硬种皮有关。曼陀罗种皮坚硬,且种皮表面角质、蜡质化。本研究发现,曼陀罗种皮的透水性、透气性差,坚硬的种皮对胚发芽具有极大的机械限制。种皮对保护种子免受伤害有积极作用,但如果自然条件下过度干旱等因素使种皮障碍无法解除将会导致种子不能正常发芽出苗。种子休眠的抑制剂作用机理认为,种子休眠是由于在种子的不同部位存在抑制物,如醛类、酚类、有机酸、脱落酸、生物碱等。本研究发现,曼陀罗种子的种皮和种仁中也存在萌发抑制物,其中,生物碱是曼陀罗主要的药用活性成分,但其是否就是抑制物的成分还有待进一步研究确定。抑制剂作用机理的激素调控学说认为,导致种子休眠不仅是由于抑制物质的存在,也可能是由于缺乏赤霉素和细胞分裂素,其中赤霉素为主要的调节因子。本研究表明,曼陀罗种皮、种仁中均有萌发抑制物,而且用外源GA3浸种可打破曼陀罗种子生理休眠,提高种子发芽率。众所周知,ABA抑制种子萌发,GA促进种子萌发,两者的比例在种子休眠与萌发中起着重要的作用。那么是否曼陀罗种子内源ABA过多或GA不足是导致其种子生理休眠的一个重要原因,有待进一步研究。曼陀罗种子生理休眠期为6~8个月,属中度休眠,随着贮藏时间的延长,种子中各种激素比例及抑制物种类、含量可能发生了变化,具体发生了哪些变化有待进一步测定研究。光敏素转化机理方面,Benvenuti研究表明,曼陀罗种子休眠不依赖于光敏素的转化,但种子入土深度及光照强度对曼陀罗种子发芽的影响有待进一步研究。3.3不同的处理对曼不同种子萌发的影响对于新采收的曼陀罗种子需要促进其萌发时,因其属于综合休眠,需用综合法来打破种子休眠。建议先用机械摩擦或酸、碱处理以破除种皮障碍,再用GA3浸种。对于采收后6~8个月的曼陀罗种子,只需要破除种皮障碍即可打破种子休眠。本研究表明用机械摩擦、浓H2SO4处理和NaOH处理均可打破曼陀罗种子种皮障碍,促进种子萌发,NaOH处理效果最好。文献报道破除硬实种子休眠最常用的方法为机械摩擦和浓H2SO4处理。用NaOH处理打破种子休眠的研究报道较少,如何学青等研究表明,羊草种子用30%NaOH处理60min,发芽率达到84%,而对照的发芽率只有6%。王继朋和王微等研究发现结缕草种子用NaOH处理,可溶解种子颖苞表面的蜡质,增加种皮的透气性和吸水率,提高种子的发芽率。关于曼陀罗种子用NaOH处理效果比浓H2SO4处理效果更好的原因我们推测是否因为曼陀罗种子中有偏酸性的萌发抑制物被碱性的NaOH中和的缘故,这还有待进一步研究验证方可得知。1)机械处理对曼陀罗种子进行剥除种皮和细沙摩擦处理后,进行发芽试验,以不做任何处理的种子作为对照。1)种仁休眠期测定曼陀罗种子采收晾干1周后剥去种皮(去除了种皮障碍影响),开始发芽试验,每隔2个月测定1次室温(温度自然变化)贮藏下种子的发芽率。其发芽床为滤纸,25℃黑暗培养,第5天时计算发芽势,第10天时计算发芽率。由图8和图9可以看出,NaOH浓度和处理时间对曼陀罗种子萌发