动物生物制品6生产基本设备与流程

第七章生物制品生产的根本设施与流程一、生物制品制造的原那么1．预防用生物制品必须是平安的，不应有明显的副作用，无相应的疾病、持续感染和过敏反响。2．预防用生物制品应具有能使机体产生保护性免疫能力．类似患病后所引起的免疫效应。3．预防用生物制品应考虑运输、保存及使用上的方便。4．预防用生物制品必须经过国家检定机构检定合格，包括流行病学效果观察证明是有效。二、生物制品制造的根本条件1.相应的厂房和动物舍；2.相应的生产设施〔培养基制造和灭菌设备；细菌培育设备；细胞培养装置；温室、冻干、冷藏等〕3.一定专业人员〔生产技术、检验技术〕4.具有防止散毒的设施和隔离条件5.消毒和排污条件6.供水供电7.经国家有关部门批准取得生产许可证。三、一般生物制品的生产流程1.由国家指定的部门领取生产用菌种或毒种启封菌〔毒〕种。2.按规程标准进行鉴定符合标准的菌〔毒〕种接种于规定的培养基或动物或禽胚胎或细胞。3.繁殖菌〔毒〕种检验纯度、接种于制苗的培养基、动物或细胞或胚胎。4.大量繁殖菌液或毒液〔1〕免疫动物、采血制成高免血清〔2〕灭活加佐剂制成灭活疫苗〔3〕减毒加保护剂制成冻干活苗〔4〕灭活制成诊断用抗原等。5.配制成半成品6.混合分装并冷藏。抗生素瓶洗烘灌塞生产联动线7.按规程抽样检验〔1〕纯粹或无菌检验〔2〕活菌计数、毒价测定〔3〕平安检验〔4〕效力检验〔5〕诊断液效价和特异性检验〔6〕冻干的残水，真空度测定〔7〕物理状态检验等。8.签发合格通知交成品库9.包装10.发运出厂、使用。四、菌〔毒〕种的选择1.菌〔毒〕种的重要性：是疫苗生产的根本是对制品质量的直接保证。2.菌〔毒〕种的选择原那么：平安性：毒力能灭活或毒力低免疫原性良好遗传学稳定无致癌性生产适用性。3.本卷须知我国现有用于生产的菌〔毒〕种，都是经过研究单位进行大量研究之后选出的。我国?兽医生物制品制造及检验规程?规定，凡经部、省〔自治区〕发给批准文号的产品，生产所需的菌〔毒〕种，由中监所或中监所委托分管的单位供给。制造用的病原微生物，必须按规程要求经过选择和鉴定后、符合标准的方得用于生产。总那么：制造死苗：标准强毒株，其免疫原性良好。制造活苗：经过严格审查、鉴定的弱毒或无毒菌株，其毒力稳定，形态特征典型，不易变异，血清型与当地流行的相同。〔一〕菌种1.菌种来源：〔1〕历史清楚：流行地区、动物种、流行资料清楚，别离鉴定资料完整，传代、保存、生物学特性检查方法明确。〔2〕生物学性状明显：以便易于鉴别。如培养、电镜、免疫、病理变化等。〔3〕遗传学性相对纯一和稳定：在生产中也经常挑选、纯化、克隆化等。〔4〕反响原性和免疫原性优良：在生产中也通常通过浓缩、提纯、导入佐剂等方法改善。〔5〕毒力在规定范围内。2、菌种鉴定：〔1〕形态及培养特性检查：〔2〕血清凝集试验：〔3〕毒力鉴定：强毒株——本动物、试验动物的致死剂量、死亡率弱毒株——致死与不致死的剂量范围等。例：?麻疹活疫苗规程?局部每批至少10只成鼠〔15~20g〕，脑内接种0.03ml和腹腔接种0.5ml，观察21d，至少有原接种小鼠80%成活，并且无一小鼠呈现因病毒种子中外源性传染因子感染，那么试验合格。所有死后24h后或有病症的小鼠均应解剖接种5只，观察21d。〔4〕免疫原性鉴定〔免疫力试验〕：用于制造菌苗的各菌种，按各自的制造方法制成菌苗，免疫实验动物，经过1~3周后，攻击致死剂量或假设干致死剂量的强毒菌，观察动物发病、死亡和保护等情况。菌种抗致死量强毒越多，保护率越高，免疫原性越好。保护率一般应能达50~80%小鼠成活，各制品的指标各不相同。〔5〕稳定性试验：制造弱毒活苗的菌种，要特别注意其毒力是否稳定在培养基上传20~30代后，其菌落形态无变化、毒力不明显增强，免疫原性不减弱，那么初步认为是稳定的。接种动物传代5~10代后，其毒力不增强那么稳定。〔6〕毒性试验：按规定制成死苗——注射小鼠〔15~18g〕〔不参加防腐剂〕，注射后3天，小鼠体重不应有降低。7天后增重不少于对照组60%增重，且不得有死亡。〔二〕毒种通过动物、鸡胚胎或细胞〔CPE、蚀斑〕来进行鉴定，依据各自的致病力及特定的组织的含毒量和对动物的免疫力作为选择和鉴定的标准。〔见例〕例1、猪瘟毒株猪瘟兔化弱毒株接种家兔

经过一定潜伏期出现定型热而无明显可见的病症。例2新城疫病毒鸡新城疫I系弱毒株

接种10日龄鸡胚，在24~72h内死亡，胎儿有明显的病变，红细胞凝集价为1:80~1:320。接种2~4月龄健康莱航鸡无不良反响为合格。1.无菌试验2.病毒毒力3.纯毒试验。五、菌苗制造〔一〕细菌的培养繁殖制造〔活菌苗、死菌苗〕首先要大量繁殖细菌，在繁殖时依据其特性进行需氧、厌氧培养，其又分为固体培养和液体培养。在50年代后逐渐开展为液体培养基大罐通气培养，它适合工厂大量培养或连续培养制造菌苗。培养罐以不锈钢或耐酸搪瓷罐为主体，装有：搅拌、通气、测温、测压、测PH、测溶解氧等。五、菌苗制造〔二〕细菌灭活苗1.将强菌株的纯培养物用物理或化学方法将其杀死或使之失去活力，再参加防腐剂或参加佐剂制成。2.此类疫苗平安，但疫苗用量大，局部有反响。五、菌苗制造3.制造程序：菌种——种子培养〔纯粹检查〕——种子液——菌液培养〔活菌计数〕——灭活——浓缩〔稀释〕——配苗〔加佐剂、防腐剂〕——分装。〔见例〕例：猪肺疫氢氧化铝菌苗选取菌株〔B型多杀性巴氏杆菌〕——接种血琼脂斜面24h作为种子——马丁肉汤37℃20h，作为种子液——接种大量马丁肉汤培养基，参加量为1%，36~37℃12~24h，——纯粹检验，计数——参加0.1%甲醛——37℃7~12h——参加菌液:Al(OH)3=5:1的Al(OH)3——分装。使用：免疫期持续6个月，皮下5ml，2~5℃保存1年，16~28℃9个月。五、菌苗制造〔三〕细菌弱毒冻干活苗1.将检验合格的种子液，按1~2%的量接种于适量的液体〔或固体〕培养基中，37℃8~24h，然后进行纯粹检验，无杂菌污染时，用于配苗，然后按7:1~5:1的比例参加保护剂〔明胶蔗糖等〕，混合分装，冻干。2.制造程序：菌种——种子培养〔纯粹检查〕——种子液——菌液培养〔活菌计数〕——浓缩〔稀释〕——配苗〔加保护剂〕——分装——预冻——真空枯燥。六、疫苗制造选用材料：病毒或含病毒的组织病毒是严格的细胞内寄生的微生物，在无细胞的条件下不能繁殖。不管制造活疫苗或死疫苗，可有如下三种途径：〔一〕接种易感动物制苗〔二〕接种鸡胚制苗〔三〕细胞培养制苗。病毒性疫苗生产流程及区域划分〔一〕接种易感动物制苗即用动物培养繁殖病毒1.动物的选择：其对动物的选择十分重要〔对该病毒易感性高；尽量使用纯种、体重和年龄应符合?规程?的要求；外购动物要经过严格的隔离观察〕。常用：小白鼠、家兔、绵羊、牛、驴、马。2.病毒材料处理〔1〕液体材料——直接离心取上清液体。〔2〕组织剪成小块研磨加缓冲液1:10稀释加1000ug链霉素和1000u青霉素，37℃1h或4℃过夜。3.接种动物4.采集材料病毒繁殖后，取含毒量高的组织器官，如脾脏、肝脏、淋巴结等5.病毒材料粉碎〔参考2步骤方法处理〕〔1〕捣粹后参加适当的稀释液〔PBS〕〔2〕铜纱网过滤除去粗粒，制成乳剂6.灭活〔活苗加保护剂冻干〕7.检验8.分装例1：水貂病毒性肠炎脏器灭活苗病毒水貂、仔猫、仔犬出现典型病症后、捕杀取胃、肠、肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏。称重、捣粹制成13~15%的生理盐水水乳剂多层纱布过滤。测定HA在1:120以上、HI阳性参加甲醛使之终浓度在0.35%，37℃24h然后在无菌的条件下开盖，包以无菌纱布，使甲醛挥发24h，必要时参加0.01%的结晶紫。例2：猪瘟活疫苗猪瘟病毒反复通过猪和兔交叉继代家兔假设干代。20~40倍稀释乳剂接种3~5日龄乳兔1ml/只36~40h冻死取心、肝、脾、肌肉组织制苗〔此种乳剂液体亦称为湿苗，或参加保护剂制成冻干疫苗〕。〔二〕接种鸡胚制苗1.优点：〔1〕鸡胚营养丰富，许多病毒可以在鸡胚中生长繁殖〔2〕鸡胚培养容易掌握，鸡蛋来源方便，价格低，不需要特殊的仪器设备，污染时机少，易于消毒。2.缺点：〔1〕很多病毒不能适应，特别是哺乳动物的病毒。〔2〕某些鸡胚可能带毒，如：新城疫病毒、禽白血病病毒、支原体、沙门氏菌等。〔3〕受感染的鸡胚一般看不到变化〔除引起死亡的外〕。〔4〕母源抗体的干扰。〔5〕有些病原可能从母鸡传递到鸡胚等。3.鸡胚的选用：〔1〕受精卵〔2〕受精卵来自未免疫接种的健康鸡群。〔3〕孵化前可用40℃温水配制的新洁尔灭或莱苏尔液体浸泡四层纱布来擦表层消毒。〔4〕孵化温度38~39℃，湿度为60~70。4.鸡胚接种：〔1〕接种鸡胚通常是7~14日龄〔2〕接种途径和方法尿囊腔：9~11日龄绒毛尿囊膜：11~13日龄卵黄囊：6~9日龄羊膜腔：10~12日龄鸡胚脑内接种：8~12日龄静脉接种：10~14日龄。〔3〕鸡胚感染病毒的标志是检查鸡胚的死亡、畸形、胚体出血、绒毛尿囊膜水肿、出血、坏死性病灶等例：NDI系弱毒疫苗受精卵消毒38.5~39℃孵化，选取发育良好的9~11日龄鸡胚100倍稀释毒种0.1ml于尿囊腔接种。接种后24h前和48h后死亡的鸡胚弃之36h死亡的立即取之，气室向上，0~10℃中冷却4~24h外表消毒。除去蛋壳剪破尿囊膜及羊膜吸取鸡胚液。参加青霉素500u/ml，链霉素500ug/ml经过无菌检验等后，分装，备用。如制冻干苗，以5%蔗糖脱脂乳为保护剂，混合，过滤，分装，冻干。〔三〕细胞培养制苗1.自50年代起，细胞培养即广泛用于病毒工作中。细胞培养分为：原代细胞——常用于病毒的别离、疫苗生产、血清学测定等；传代细胞——制苗、病毒的别离细胞系——不适合制苗。〔二〕接种鸡胚制苗2.常用的原代细胞：〔1〕鸡胚细胞：用于鸡马立克病、新城疫、鸡痘、鸭瘟、伪狂犬病等疫苗的制造。制法：9~10日龄鸡胚——胎儿去头、爪、——PBS洗3次——剪成0.5~1.0mm小块，参加组织量5~10倍的0.25%胰酶液36~37℃水浴消化10~30min——弃胰酶——洗3次——培养37℃，24~48h长成单层即可接毒。〔2〕兔、地鼠、绵羊、山羊、猪肾脏细胞：用于伪狂犬病、马脑炎、羊痘、猪瘟等疫苗的制造。〔3〕牛、羊睾丸细胞：用于猪瘟、绵羊痘、山羊痘等弱毒疫苗的制造。〔4〕驴白细胞：用于培养马传染性贫血病毒，制造弱毒疫苗。细胞培养制苗:细胞转瓶机结构例：马立克火鸡疱疹病毒细胞苗鸡胚细胞单层——倒掉营养液——参加含毒细胞的裂解液〔1:60~1:100〕——加维持液——37.5~38.5℃培养64~72h——待60%以上的单层细胞出现典型的细胞病变时——收获细胞液——裂解——冻干——支原体检验——出厂七、冷冻真空枯燥技术及冻干保护剂特点：蛋白质、微生物、酶、激素等冻干后变性很少，生物活性仍能得到保持。优点:〔1〕使不稳定的物质在冻干过程中失去绝大局部水分，保持不变质，延长有效的保存时间，便于储藏。〔2〕冻干制品加水后易于溶解恢复原状，便于使用。〔一〕冷冻真空枯燥的根本原理1.原理：〔1〕根据热力学中的相平衡理论，随压力的降低，水的冰点变化不大，而沸点却越来越低，向冰点靠近。〔2〕当压力降到一定的真空度时，水的沸点和冰点重合，冰就可以不经液态而直接汽化为气体，这一过程称为升华。〔3〕真空冷冻枯燥是在水的三相点以下，即在低温低压条件下，使生物制品中冻结的水分升华而脱去。2.真空冷冻枯燥器〔1〕冷冻枯燥机组成:制冷系统真空系统加热系统控制系统。〔二〕冷冻真空枯燥的操作程序1.预冻：共熔点：不同溶剂和溶质全部凝成固体的温度。一般共溶点在——-20~-35℃，故预冷那么在-40℃以下。要求：〔1〕快速冷冻对细胞的影响较小，缓慢冷冻容易引起细胞死亡。〔2〕生物