目的基因的遗传转化

实验十目的基因的遗传转化一、目的基因的表达载体构建1.实验目的本实验以强化植物基因工程平台技能训练为目的，涵盖PCR分离克隆全长目的基因、Gateway技术构建目的基因的表达载体、农杆菌介导目的基因的转化、转基因植株的驯化和移栽等系列实验。此外，还就如何利用新型的反向遗传学技术RNAi（RNAinterfere，RNA干涉）进行基因功能研究进行试验指导。为从事相关领域的科学研究奠定基础。通过本实验，要求学生理解和掌握Gateway技术构建目的基因的表达载体的基本原理和具体实验步骤。2.实验原理利用高保真聚合酶，采用PCR方法在克隆基因两侧引入attB重组位点，然后将含有attB位点的PCR产物与含有attp位点和GatewayBPClonase混合，之后转化E.coli。在两对att位点之间的位点特异性重组过程中产生一个融合载体，融合载体随即分解成两个分子，重组位点在结构上重新分配，目标基因进入新的载体骨架，通过筛选阳性克隆，获得此重组产物，称为“entry克隆”。在得到的entry克隆中目标基因位于att重组位点之间。将此重组产物与选定的Gateway载体和GatewayLRClonase酶混合，在entry克隆中的attL位点间的序列取代表达（目标）载体的attR位点之间的序列即目标基因进入表达载体，形成表达（目标）3.仪器设备微量取液器、制冰机、微型离心机、PCR仪、凝胶成像系统、毛细管自动测序仪、电子天平、高速冷冻离心机、振荡器、恒温金属浴、干燥箱、紫外分光光度计、电泳仪、-80°C冰箱、-20C冰箱等。4.实验试剂克隆全长基因，pDONRT呛21载体（Invitrogen，12535-019）,目标载体（购自Invitrogen，类型可选)。核酸和质粒提取试剂，测序试剂，T-vector,DNA片段回收试剂盒，Taq聚合酶，反转录试剂盒，DNAmarker，氨苄青霉素，X-gal,IPTG等试剂的配方和购买公司见模块一中相应章节。(2)BPClonaseTMEnzymeMix(11789-013)*12、LRClonaseTMEnzymeMix*13(11791-019)均购自Invirtrogen公司。5.实验方法克隆含有B序列的目标基因：设计B序列引物，用于扩增带有B序列接头全长基因。利用上面第一组引物，进行PCR反应。以在全长基因上加入一半B序列的扩增产物为模板，进行第二次PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测。纯化含有B序列PCR产物(磁珠回收纯化法)。克隆产物与T载体的连接。连接产物的转化。(6)阳性克隆的筛选及质粒提取。(7)DNA序列测定。BP反应：(1)BP反应的目的在于将含有线性attB表达克隆或attB接头的PCR产物克隆到含有attP的donor载体上以产生entry克隆。attB-PCR产物或线性attB表达克隆0.5卩LTOC\o"1-5"\h\zpDONR221 1卩L\o"CurrentDocument"5XBPClonaseTMReactionBuffer4pLTEBuffer(pH8.0) 10卩L\o"CurrentDocument"BPClonaseTMenzymemix 4pLTotal 20pL25°C温育16hr,之后向体系中加入2pL蛋白酶K溶液，37°C温育10min，以终止BP反应。BP反应产物的转化。阳性克隆的鉴定。LP反应：LR反应的目的在于将已经重组入entry载体的目标基因再克隆到表达(目标)载体，以产生表达(目标)克隆。

TOC\o"1-5"\h\z表达(目标)载体 lyL\o"CurrentDocument"Entryclone(100-300ng) 1yL\o"CurrentDocument"5XLRClonaseTMReactionBuffer4yLTEBuffer(pH8.0) 10yL\o"CurrentDocument"LRClonaseTMenzymemix 4yLTotal 20yL25°C温育16hr,之后向体系中加入2yL蛋白酶K溶液，37°C温育10min,以终止LR反应。LR反应产物的转化。对阳性克隆可采用PCR和酶切结合进行鉴定。EcoRV酶切后电泳见左下图。重组质粒图谱见右下图。2000bp1000750bp—►500bp—250bpf100bpMDREB1A816bpPH2GW7.DREB1ASm/SpRCai佰仙pH2GW7-DREB1A2000bp1000750bp—►500bp—250bpf100bpMDREB1A816bpPH2GW7.DREB1ASm/SpRCai佰仙pH2GW7-DREB1A重组质粒图谱Pstl(104&)Ecogy(1066)Sacl(1)Sacft(10565) /NeoI(53)Aatff(10356) \ //Neo!(443}\XhQ!{1420)'\SacI(1427)''EcoRV(1939)T35SPstl(2174)'^atl/(2186)pa!(2192)血曲"2伯4)酶切电泳图6.注意事项attB上下游PCR引■的设计在遵循引物设计原则的基础上，还必须满足以下条件:1)5'末端具有4个1)5'末端具有4个G残基。2)4个G残基与25bp的AttB1位点相连。3)至少有18-25bp的特异基因序列或模板序列。attB上游引物位点末端连有T残基。如果需要PCR产物与N末端标签框架结合，引物必须包括另外两个碱基，使得在AttB1区域保持正确的读码框。这两个碱基不能是GA、AA或AG,以防形成终止密码子。对于下游引物而言，如果需要PCR产物与C末端标签框架结合，引物必须包括另外一个碱基，使attB2区域保持正确的读码框。同时，任何存在于attB2位点和目的基因之间的终止密码子必须被去除。如果不需要PCR产物与C末端标签框架结合，则克隆基因或引物必须包含终止密码子。7.作业(1)Gateway技术原理是什么？

（2）载体上具备ccdB基因的意义是什么？二、愈伤组织的遗传转化及转基因植株的检测实验目的掌握诱导水稻胚性愈伤组织方法；掌握农杆菌介导的遗传转化及转基因植株检测的原理及实验步骤。实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的革兰氏阳性菌，它能在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。当农杆菌通过植物伤口进入细胞后，可将农杆菌细胞中的一段T-DNA插入到植物基因组中，是一种天然的植物遗传转化体系。将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物基因组的转移和整合,然后通过细胞和组织培养技术再生出转基因植株。近年来，农杆菌介导法广泛地应用在一些单子叶植物（尤其是水稻）的遗传转化中。种子(2N6)愈伤组织（种子(2N6)愈伤组织（2N6）愈伤组织前培养(2N6) 农杆菌(AB)OD60=O.15-O.23d (AAI+AS)(2N6-CO)抗性愈伤组织筛选「2-3周生根（10d）再分化丄2-3周生根（10d）再分化丄2-3周2N6+适当抗生素三引再分化培养基水稻愈伤组织遗传转化流程图仪器设备机械脱壳机，50mL无菌试管（若干），灭菌培养皿，灭菌烧杯（若干），灭菌滤纸，灭菌镊子。灭菌滤纸、烧杯、镊子、吸水纸、无菌三角瓶、培养皿。实验试剂（1） 1.5%次氯酸钠消毒液。（2） 70%酒精，无菌水，蔗糖。3)N6BasalSaltmixture：1000xN6维生素ImLTOC\o"1-5"\h\zGlycine 2gNicotineacid 0.5gPiridoxineHCl 0.5g(4)2,4-D(2,4-dichlorohenoxyaceticacid)，琼脂糖ThiamineHCl 1g(AgarosetypeI；sigma,A-6013)。定溶至 1L(5)琼脂糖。潮霉素(Hygromycin)溶液(50mg/mL)。乙酰丁香酮(AS)溶液。农杆菌培养(AB)母液。农杆菌悬浮液(AAI)母液。5.实验方法(1)诱导愈伤组织。培养农杆菌。用接菌环从农杆菌(PIG121)原液中蘸取少许菌液，在AB培养基上划线。28€黑暗培养2-3do配置AAI培养基，调pH至5.2。分装，每管100mL，高压灭菌，使用前加入10卩L/100mLAS(乙酰丁香酮)。在无菌的试管中加入25mL含有AS的AAI培养基，收集步骤3中的农杆菌(用药匙刮取平板上的农杆菌)，混匀,25°C黑暗条件下振荡培养2-3hr。测OD600值。用加入AS的AAI培养基稀释菌液至600OD=0.15-0.2。600侵染和共培养：取500pL菌液于1.5mL离心管中，4C、4000rpm条件下离心2min，弃上清。用含200pmol/LAS的30mLAAM侵染液制成悬浮液(菌液OD600的终浓度为0.01)；挑选一定大小的水稻愈伤组织，放入农杆菌悬浮液中侵染5min；取出愈伤组织，置于无菌的滤纸上沥干30-40min；将愈伤组织置于共培养培养基(N6-CO)上,在25C暗培养2.5-3do选择性培养基的配制：1000xN6维生素1mLCassminoacids0.3gProline2.8g蔗糖30g2,4-D2mg定溶至1L调pH到5.7，加入4.0gGelrite，高压灭菌。当培养基的温度下降到60€时，加入Carbenicillin(500mg/L)和Hygromycin(50mg/L),混匀，倒平板。5)抗性愈伤组织的选择：取出愈伤组织，无菌水清洗5-6次，其间需不停地振荡。再用含500mg/LCarbenicillin的无菌水清洗1-2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2hr。凉干的愈伤组织转入选择性培养基上进行第一轮选择，30°C,3000Lx光照条件下，培养14do具有抗性的初始愈伤组织继代到选择性培养基上进行第二轮选择，30C，3000Lx光照条件下培养，直到颗粒状抗性愈伤组织生成为止。配制再分化培养基(MS)：Kinetin2.0mg/LNAA0.2mg/LSorbitol20g/LSucrose30g/L定溶至 1L定溶至1L,调pH至5.7,加入4.0gGelrite，高压灭菌，当培养基的温度下降到60C时，加入Carbenicillin(300mg/L)和Hygromycin(40mg/L)，混匀，倒平板。配制生根培养基(1/2MS)：Sucrose 10g/LN6vitamins 5mL定溶至 1L调pH至5.7，加入4.0gGelrite，高压灭菌，当培养基的温度下降到60C时，加入Carbenicillin(300mg/L)和Hygromycin(50mg/L)，混匀，