白介素-10基因敲除小鼠炎性肠病模型肠屏障的修复

白介素-10基因敲除小鼠炎性肠病模型肠屏障的修复

虽然未清楚xygram的病因，但xybflimate（ibd）的病因尚未得到清楚的评估，但人们普遍认为，肠道菌群中各种抗生素对遗传易感细胞的持续刺激是导致肠道疾病的重要因素。已有研究表明,肠道菌群是IBD发生、发展的先决条件,而益生菌具有较强的菌群调节能力。近年来的研究亦表明,益生菌能够有效缓解IBD患者的临床表现,具有积极的治疗作用。尽管如此,目前尚缺乏有关益生菌对IBD作用机理的深入研究。为此,本实验以国际上普遍采用的白介素10基因敲除(IL-10-/-)小鼠为IBD模型,开展植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum,LP)对肠屏障功能的修复机理研究。1材料和方法1.1il-10-/-小鼠及野生型wt小鼠的培养和培养LP由上海交大昂立医药研究院提供,以低压冻干菌粉的形式在-20℃以下保存,菌粉用Ringer缓冲液稀释后2h内经改良MC培养基37℃厌氧培养48h,其活菌数达5×1010CFU/g。129品系IL-10-/-小鼠及野生型(WT)小鼠均购自美国JacksonLaboratories公司。本实验所使用的小鼠均为8周龄雌性小鼠,并以IL-10-/-小鼠作为IBD模型。1.2材料和实验方法ZO-1抗体(SantaCruz,CA,USA),occludin、β-catenin、claudin-1抗体(SanFrancisco,CA,USA)。IRDye-800或IRDye-700标记的二抗,LI-CORBioscience,Lincoln,NE。Ringer缓冲液、改良MC培养基和MRS培养基,上海市疾控中心。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)检测试剂盒,BDPharmingen,Oxford,UK;厌氧罐和厌氧产气袋,生物梅里埃公司;MicroscanAutoscan-4细菌鉴定系统和RA-ID板,DadeBehring公司;SW-CJ超净工作台,苏州净化设备有限公司;DNP-9028恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司;TMQ.R-3250压力蒸汽灭菌器,山东新华医疗器械股份有限公司;HHS型恒温水浴锅,上海博讯有限公司;VM-10漩涡振荡器,上海精科实业有限公司;Ultra-Turrax匀浆仪,IRK-WERKE,Germany;透射电镜,Philip,Eindhoven,Netherlands;UssingChamber,EasyMountChamber,PhysiologicInstruments,SanDiego,CA,USA;OdysseyInfrare图像分析系统,LI-CORBioscience,Lincoln,NE。1.3方法1.3.133cfp悬液的配制LP菌株于MRS液体培养基中37℃厌氧培养12h,5000r/min(r=6cm)离心5min后除去上清液,菌体重悬于无菌Ringer缓冲液中,利用分光光度法配制成2.0×109CFU/ml浓度的LP悬液。1.3.2益生菌干预组1.将8周龄雌性小鼠采用简单随机法(随机表)分成WT组、WT+LP组、IL-10-/-组和IL-10-/-+LP组,每组10只。益生菌干预组每日灌胃0.5mlLP液(1.0×109CFU),其余灌胃Ringer缓冲液0.5ml,持续4周。于实验开始后第0、2、4周收集小鼠粪便样本,检测肠道菌群变化,于实验结束后收集结肠组织行组织学、通透性和电生理及紧密连接蛋白表达研究,并对各组小鼠腹泻、直肠脱垂和体重变化情况予以监测。1.3.3炎症评估结肠组织用10%甲醛固定,经常规处理、6μm切片、HE染色后镜检,观察其组织结构并给予炎症评分。1.3.4turrax匀浆条件的确定将切取的结肠组织置于800μl含有PBS、2%FCS和0.5%溴化十六烷基三甲胺的冷匀浆液中,用Ultra-Turrax匀浆仪匀浆后在4℃离心15min(17940×g)。按照ELISA试剂盒说明检测上清液中TNF-α和IFN-γ浓度,以pg/mg组织表示。1.3.5阿利克氏体的制备将小鼠新鲜结肠组织经PBS冲洗后用组织包埋剂包埋(Sakura,USA),并置于-80℃保存。将冰冻组织10μm切片后在95℃10mmol/L枸橼酸钠溶液中孵育5min,冷却至室温。用含有5%牛血清白蛋白和5%胎牛血清的PBS室温下孵育30min以消除非特异性背景。将以上切片与紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1、occludin和β-catenin一抗在4℃下孵育过夜,再用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽室温下染色1h。再经相应荧光素标记的二抗孵育后,在激光共聚焦显微镜下观察蛋白定位。1.3.6脱氧胆酸盐类将结肠组织超声粉碎后置于冷的裂解液中[1μl/ml缓冲液,50mmol/LTris-HCl,pH7.4,150mmol/LNaCl,1%NP-40(IgepalCA-630),0.5%脱氧胆酸盐,0.1%十二烷硫酸钠和5mmol/LEDTA],裂解60min。按照Zeissig等方法将提取蛋白分离、一抗(ZO-1、claudin-1、occludin、β-catenin),用IRDye-800或IRDye-700标记的二抗孵育,以β-tubulin作为内参,OdysseyInfrare图像分析系统进行荧光定量分析,结果以相对丰度表示。1.3.7添加甘露醇根据Madsen等的方法,检测肠上皮细胞跨膜电阻(TER)和细胞旁路甘露醇通透性,以此反映肠上皮的屏障功能。将新鲜剥离的结肠黏膜组织固定于UssingChamber,两侧室灌注3ml37℃氧合Krebs缓冲液。调节电压钳零电压,以1mV刺激电压每隔60s刺激0.5s,记录跨膜电流(ΔIsc)和电压(PD),TER=PD/ΔIsc。为检测肠上皮细胞旁路甘露醇通透性,将3%甘露醇添加到黏膜面侧溶液中,平衡30min后,每隔30min抽取浆膜面溶液200μl,持续2h,并置于液氮中保存。实验结束后利用HPLC检测甘露醇浓度。1.3.8皮细胞间联合组织观察结肠标本冲洗后切成10mm×5mm大小,2%戊二醛固定,4℃孵育2h,经系列脱水后环氧树脂包埋,超微切片(80nm),透射电镜观察上皮细胞间紧密连接超微结构变化。1.4组患者ssa采用SPSS13.0软件包进行统计,计量数据以x¯±sx¯±s表示,采用单因素方差分析(One-WayANOVA),组间比较采用SNK法,检验水准α=0.05。2结果2.1cp有助于减少肠道炎症2.1.1中性细胞和细胞浸渍组织学分析显示,IL-10-/-组小鼠均有结肠炎症表现,表现为黏膜溃疡、糜烂和大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润;而益生菌干预后,IL-10-/-+LP组小鼠仅表现为轻度中性粒细胞和淋巴细胞浸润,WT组和WT+LP组小鼠无以上炎症表现,见图1。2.1.2两组小鼠腹泻和肠推荐干预的比较,见表1IL-10-/-组小鼠腹泻和直肠脱垂发生率显著高于WT组[70%(7/10)比0(0/10),P<0.01;20%(2/10)比0(0/10),P<0.01];LP干预后,IL-10-/-+LP组小鼠较IL-10-/-组腹泻和直肠脱垂发生率明显降低[30%(3/10)比70%(7/10),P<0.01;0(0/10)比20%(2/10),P<0.01]。实验结束后,IL-10-/-+LP组小鼠较IL-10-/-组小鼠体重出现明显的增加[(22.1±1.8)g比(20.3±1.7)g,P<0.01]。2.1.3周lp治疗前后il-10-/-+lp组与il-10-/-+lp组治疗前后炎症评分比较IL-10-/-组炎症评分明显高于WT组(P<0.01);而经4周LP治疗后,IL-10-/-+LP组较IL-10-/-组炎症评分出现了明显降低(P<0.01),但并未恢复至正常水平;WT组与WT+LP组的炎症评分比较差异无统计学意义(P>0.05),见图2。2.1.4wt组与wt组比较IL-10-/-组小鼠促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ浓度较WT组显著增高(P<0.01);LP干预后,IL-10-/-+LP组小鼠较IL-10-/-组TNF-α和IFN-γ浓度明显降低(P<0.01),见图3A和图3B。2.2lc促进了紧密连接紧密蛋白的出现2.2.1enin分布WT组和WT+LP组紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和β-catenin主要分布在肠上皮细胞顶膜,呈连续性分布;而IL-10-/-组小鼠则表现出紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和β-catenin在细胞顶膜的荧光强度减弱和不连续性分布,且ZO-1、occludin和β-catenin存在细胞内异常分布,见图4。2.2.2claudin、claudin-1、claudin-1及claudin-1的表达定性检测结果见图5。定量检测结果(图6A～6D)显示,IL-10-/-组小鼠肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1表达较WT组均出现下降(P<0.01),而β-catenin表达虽然降低,但差异无统计学意义(P>0.05);而经4周LP干预治疗后,IL-10-/-+LP组较IL-10-/-组紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1表达均显著增强(P<0.01)。2.3lc降低了细胞的侧路渗透性，防止肠上皮细胞的超微结构破坏2.3.1ter0.763.4IL-10-/-组小鼠肠上皮细胞旁路对甘露醇的累积通透性明显高于WT组[(2.17±0.37)%比(0.76±0.14)%,P<0.001;见图7A],且TER出现了明显降低[(38.31±12.70)Ω/cm2比(73.34±3.91)Ω/cm2,P<0.001;见图7B];而LP干预后,IL-10-/-+LP组较IL-10-/-组的甘露醇累积通透性显著降低2.3.2小鼠肠上皮细胞超微结构的变化透射电镜分析表明,WT组和WT+LP组小鼠肠上皮结构完整,而IL-10-/-组小鼠肠上皮细胞超微结构变化明显,表现为紧密连接结构、微绒毛的破坏、细胞间缝隙增宽、细胞空泡化及染色体沉积,甚至上皮细胞的凋亡;LP治疗4周后能明显减轻以上IL-10-/-组小鼠肠上皮细胞的破坏(图8A～8D)。3益生菌改善肠道屏障功能相关因素近年来,随着人民生活水平的提高,IBD在我国的发病率逐年增高,而IBD病因至今未明,且无法治愈,严重影响了患者生活质量。目前认为,IBD是遗传、环境、免疫等因素综合作用的结果,而肠上皮屏障功能障碍在IBD发病机理中起到了至关重要的作用。临床研究证实,克罗恩病(CD)患者存在肠上皮屏障功能障碍,表现为通透性增加,且其10%～20%一级健康亲属亦存在肠上皮通透性增加;进一步研究发现,肠上皮通透性增加与上皮细胞间连接蛋白的低表达和(或)分布异常有关。此外,CD患者亦常发生肠道菌群失调和细菌移位。以上提示,来自异常肠道菌群的大量抗原能透过受损的肠上皮细胞屏障持续刺激肠黏膜下免疫细胞,引起肠上皮损伤,导致肠炎的发生、发展。而研究证实,益生菌具有调节肠道菌群和增强肠道屏障功能的作用,但其具体作用机制尚不明确。体外实验研究显示,益生菌能有效阻止致病性大肠杆菌(EPEC)引起的肠上皮细胞Caco-2细胞旁路通透性的增加和TER的降低,从而修复了受损的肠上皮细胞屏障。有研究发现,益生菌的这种作用与其阻止EPEC诱导的紧密连接蛋白异常分布和磷酸化水平降低有关。我们先前研究亦证实,LP能通过增强紧密连接蛋白(ZO-1、claudin-1、occludin、JAMA-1)在细胞顶膜的表达来阻止EPEC对Caco-2细胞屏障功能的破坏作用。以上研究均提示益生菌对肠道上皮屏障功能的修复作用可能与其促进细胞间紧密连接蛋白