血管生成素-1对anp模型小鼠胰性脑病的治疗作用

血管生成素-1对anp模型小鼠胰性脑病的治疗作用

胰腺疾病（pe）是胰腺由刺激引起的神经精神障碍综合征。其发病机制非常复杂，是由多种因素引起的病理过程。其中胰酶激活,炎症介质、细胞因子和氧自由基大量释放,微循环障碍,低氧血症,细菌感染等是胰腺炎并发PE病理损害的主要机制。目前国内外多项实验研究证实血管生成素-1(Ang-1)具有抗炎、维持血管稳定、抗血管渗漏和减轻局部炎症等作用。Ang-1具有抑制炎性因子及改善微循环的特点可能为胰腺炎及其并发症PE的治疗提供一个合适的新的治疗靶点。本研究旨在探讨Ang-1蛋白对小鼠胰腺炎并发PE的靶向治疗作用,从而为PE提供可能的治疗线索。1材料和方法1.1动物中心提供Balb/c小鼠54只,雌雄各半,体质量25～30g,由河北医科大学实验动物中心提供;雨蛙素(cerulein)及Ang-1购自美国Sigma公司;小鼠白细胞介素6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附试验试剂盒购自美国ADL有限公司,丙二醛检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.2模型的制备和推广54只Balb/c小鼠,随机分为3组:对照组,急性坏死性胰腺炎(ANP)模型组和Ang-1治疗组,每组18只;各组又按采样时间点分为9,18,24h亚组,每组6只。模型的制备参照文献的方法并进行改良。模型组和Ang-1治疗组小鼠术前12h禁食不禁水,经小鼠腹腔注射雨蛙素(50μg/kg),1次/h,共7次。A组小鼠腹腔注射等量生理盐水,1次/h,共7次。Ang-1治疗组在制备动物疾病模型完成1h后,腹腔内注射Ang-1(100μg/kg)。而后按预定时间点,去眼球采集血标本,同时采集胰腺和脑组织。1.3指标和方法1.3.1血清淀粉酶用荷兰全自动生化分析仪测定。1.3.2血清il-6和tnf-i的含量采用双抗夹心酶联免疫吸附试验测定血清IL-6及TNF-α浓度。均严格按照试剂盒说明书进行操作。1.3.3比w/v对制备表面的测定取部分脑组织按重量/冰生理盐水体积比(W/V)=1/4常规制备20%的匀浆;采用硫代巴比妥酸法检测MDA。操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。1.3.4脑含水量测定采用干重、湿重法测定。取脑组织1块,电子天平称湿重后,置真空恒温干燥箱内,100℃烘烤24h称干重,计算脑组织含水量。脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。1.3.5胰腺组织检查取胰腺组织苏木精-伊红染色,镜下观察。用双盲法按Schmidt′s标准行胰腺组织病理学评分。1.3.6在内的微血管中的白细胞计数脑组织切片苏木精-伊红染色后,光镜下每张切片观察脑微血管断面20个,并计数20个血管断面内白细胞总数。每组均取10张切片求均数。1.4均数值的描述所有数据采用SPSS13.0统计学软件处理。结果以均数±标准差(ˉx±s)表示。采用t检验进行两组均数间比较。P<0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1两组治疗组与模型组比较各时点小鼠血清中淀粉酶,IL-6,TNF-α水平,模型组均明显高于对照组(P<0.05);而治疗组明显低于模型组(P<0.05),差异均有统计学意义。各时点小鼠脑组织MDA水平,模型组明显高于对照组(P<0.05),而治疗组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1-4)。2.2脑水处理各时点小鼠脑组织含水量,模型组明显高于对照组(P<0.05),而治疗组明显低于模型组(P<0.05),差异均有统计学意义(表5)。2.3胰腺组织病理学检测对照组胰腺小叶形态正常,间质内无炎症细胞及红细胞(图1)。模型组胰腺小叶排列紊乱,局限性小叶间距离增宽,小叶间可见少量炎症细胞及红细胞(图2);治疗组胰腺小叶间隔增宽,导管周围炎性浸润,间质内少量炎症细胞及红细胞散在分布(图3)。胰腺组织病理学评分:模型组与对照组相比,前者各亚组损伤程度均较对照组各亚组加重(P<0.05);治疗组各亚组胰腺损伤的组织病理学评分均低于模型组各亚组(P<0.05)(表6)。2.4两组治疗组和模型组之间的比较各时点小鼠脑组织微血管内白细胞计数模型组明显高于对照组(P<0.05),而治疗组明显低于模型组,其差异有统计学意义(P<0.05)(表7)。3ang-1和mda的互动关系PE发生率约占急性胰腺炎的9%～20%,其发生提示病情恶化,预后不良,病死率高达67%～100%。近年来随着胰腺炎发病率的逐年升高,PE亦成为国内外的研究热点。PE病理过程复杂,它受胰酶激活,炎症介质、细胞因子和氧自由基的大量释放,细菌及真菌感染,微循环障碍等多因素影响,研究表明给予脑复苏及神经营养支持有助于本病治疗。最新实验研究证实,重症急性胰腺炎大鼠的血清淀粉酶和TNF-α及IL-6水平升高,脑组织含水量增加,组织大片坏死、出血,有髓神经明显脱髓鞘呈“洋葱样”改变,延髓及脊髓脱髓鞘及神经细胞肿胀,均提示胰腺炎产生的炎症介质,如TNF-α,IL-6等在PE的发生发展过程中发挥关键性作用。其机制可能包括:(1)活化膜磷脂酶A2引起花生四烯酸代谢紊乱,加剧炎症反应,造成细胞功能障碍;(2)TNF-α和IL-6是胰腺炎最早升高的细胞因子,可诱导IL-1及IL-8等促炎因子的表达并引起级联反应造成炎症介质的失控性释放,即“瀑布样效应”;(3)通过激活内皮细胞表达黏附分子,如内皮—白细胞黏附因子(ELAM-l)和细胞间黏附分子(ICAM-1),介导炎性细胞聚集、黏附于血管内皮,刺激内皮细胞收缩,间隙增宽,增加血管通透性;(5)炎性损伤,延髓及脊髓脱髓鞘和神经细胞肿胀,并且对髓鞘发挥直接毒性作用;(6)刺激血管内皮细胞释放血小板活化因子(PAF)及血管内皮生长因子(VEGF)和氧自由基等介质最终导致脑毛细血管栓塞和内皮损伤。Ang-1是血管生成素家族成员之一,它可通过激活其受体酪氨酸激酶(Tie2)而起到抑制内皮细胞凋亡、减少促炎基因表达和炎症介质的产生,维持血管稳定、抗血管渗漏和减轻局部炎症等作用。Ang-1能抑制ELAM-l(PECAM-1)和血管内皮黏着素(VE-adherin)等的表达,减少中性粒细胞浸润、黏附,干扰由黏附分子所介导的中性粒细胞和内皮细胞之间的相互作用,并能阻止TNF-α和IL-6引起的中性粒细胞迁徙出内皮细胞层,从而对抗内毒素血症或过氧化氢诱导致肺损伤的血管内膜渗漏。Ang-1抑制TNF-α,IL-6等促炎因子释放也受Tie2受体磷酸化与核因子κB(NF-κB)抑制剂的相互作用。本实验中Ang-1治疗组血清TNF-α及IL-6水平明显低于模型组,差异有显著性(P<0.05)。表明Ang-1可以抑制促炎因子TNF-α及IL-6的释放,从而减轻脑组织损害。MDA是脂质过氧化反应的终产物,其水平可反映机体内脂质过氧化的程度以及机体内氧自由基水平,同时又间接反映机体细胞受氧自由基攻击的严重程度。MDA在重症急性胰腺炎伴发PE的发病机理中可能起重要作用。其增高的可能机制:(1)胰酶激活黄嘌呤氧化酶,后者催化次黄嘌呤产生MDA,透过血脑屏障而损害脑组织。(2)PLA2及炎性介质和损伤的血管内皮细胞均可活化血小板,释放氧自由基。(3)PE晚期随着多系统器官衰竭的发生,脑组织进一步被破坏并继发微血管血栓形成,加剧脑组织缺氧,产生的OFR加重脑损害。本实验结果显示,模型制作9h后可见MDA含量增高,改变的程度与血清淀粉酶水平、胰腺组织的病理改变相一致。治疗组给予Ang-1治疗后,脑组织匀浆中MDA水平未见明显下降,与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。说明Ang-1并不能显著降低机体氧自由基水平;其减轻胰腺组织损伤,保护大脑功能可能与机体氧化应激反应无直接关系。Ang-1能通过调节内皮细胞通透性、抗血管渗漏,起到降低血脑屏障通透性,减轻血管源性脑水肿,保护神经元,减轻脑损伤的作用。其机制部分是通过Rho家族小GTP酶RhoA所介导的路径调整肌球蛋白、微丝肌动蛋白间的相互作用而完成的。有学者发现Ang-1调节内皮细胞通透性与PECAM-1和钙黏蛋白在细胞表面的重新分布及细胞间连接紧密相关。Ang-1影响着跨膜结合蛋白产生的相邻细胞间连接力,特别是血管内皮细胞钙依赖黏连蛋白复合物;同时Ang-1也是一种针对VEGF所介导的血管高渗透性