凝血酶对富血小板血浆修复骨缺损的影响

凝血酶对富血小板血浆修复骨缺损的影响

1骨肉瘤的制备设计：随机动物实验和细胞病理学观察。时间及地点:于2006-12/2008-09在解放军南京军区福州总院动物实验中心和福建医科大学附属口腔医院中心实验室完成。材料:成年雄性新西兰大白兔16只由上海松联实验动物厂提供,7月龄,2.5kg左右。实验过程中对动物处置符合科学技术部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。实验中应用的药物、试剂及仪器:实验方法:富血小板血浆的制取:从16只新西兰兔耳中央动脉抽取全血约10mL,采用前期实验方法制取富血小板血浆,分别对全血和富血小板血浆进行血小板计数。稀释富血小板血浆,使其中的血小板最终计数为全血的5倍左右。将富血小板血浆分成3等分装入Ep管中待用。新西兰兔颅骨缺损模型的的建立及治疗:16只成年雄性新西兰兔,术前1d给予肌注青霉素40万单位,全麻后自颅顶剔净毛发,常规消毒,铺洞巾,局部注射利多卡因,切开,剥离骨膜,暴露颅骨,分别制备4个8mm直径的全厚层骨缺损(见图1a)。按随机数字表法分别将下列充填物,60U/mL凝血酶+富血小板血浆+β-磷酸三钙、1000U/mL凝血酶+富血小板血浆+β-磷酸三钙、富血小板血浆+β-磷酸三钙、β-磷酸三钙植入4个缺损区域内(见图1b),其中富血小板血浆与凝血酶体积比例为9∶1,关闭缝合伤口,术后给予肌注青霉素40万单位1d,正常饮食饲养。组织标本的制备:术后第1,3个月分别处死新西兰兔7只和9只,取含术区4个缺损的颅骨全厚层,拍X射线片,体积分数10%甲醛固定1周,脱钙3个月,梯度脱水,浸蜡,包埋,制备5μm厚的切片,切片方向为冠状位,所有的分析的切片均位于缺损中心处附近,并做Cason改良三色法染色。主要观察指标:在普通光镜下观察颅骨缺损部位骨生成情况。计算各组新骨生成面积百分数,新骨生成面积百分数(%)=新骨生成面积/缺损面积。设计、实施、评估者:设计为第一作者,实施、评估为全部作者,经过正规培训。统计学分析:由第一、二作者采用SPSS11.5进行数据处理,数据以表示,所有组别作方差分析后,再作同一时间点下的不同组别以及同一处理方法不同时间点的多重SNK法两两比较。2结果2.1动物的数量分析2.2社会学观察的结果2.3骨组织缺损区密度大体及X射线观察结果:术后1个月:所有标本β-磷酸三钙基本没有降解,尚未见血管长入,与周围正常骨组织紧密连成一片,缺损大小基本不变;X射线显示边界清晰,缺损区密度较为均一,见图4a。术后3个月:β-磷酸三钙可见部分降解,颗粒变小,可见血管长入,各组缺损区均有不同程度的缩小,X射线显示各组缺损边缘模糊不清,缺损周边部分密度高于缺损中心部位,与其他正常部位的骨密度相当,见图4b。2.4著性意义p统计结果表明,术后1个月,各富血小板血浆组的新骨生成百分数高于β-磷酸三钙组(P<0.05),但富血小板血浆各组差别无显著性意义(P>0.05);术后3个月,各组新骨生成百分数均明显高于术后1个月,其中含有富血小板血浆组新骨生成百分数明显高于β-磷酸三钙组(P<0.05),且富血小板血浆+β-磷酸三钙组高于其他3组(P<0.05),60U/mL凝血酶+富血小板血浆+β-磷酸三钙、1000U/mL凝血酶+富血小板血浆+β-磷酸三钙组差别无显著性意义(P>0.05),见图5。2.5富血小板血浆血小板的ndf全血血小板计数(449.38±154.01)×109L-1,2次法离心后制取的富血小板血浆血小板计数为(2388.75±1560.24)×109L-1,浓缩调整后的富血小板血浆的血小板均为全血的5倍左右。3凝血酶激活与ml检测有报道认为富血小板血浆能促进组织的再生修复,如PRP用于处理拔牙创口可减轻患者的疼痛不适,减少牙槽炎症的发生,加速创口愈合;富血小板血浆可加速骨沉积的速度和骨生成的质量,治疗种植体周围炎所致的种植体周围骨缺损,疗效显著;富血小板血浆单独或复合移植材料能提高组织引导再生膜的治疗效果,有效治疗牙周炎造成的骨破坏,改善牙周临床各项指标。然而,也有研究发现使用富血小板血浆并不一定能达到预期的效果。由此可见,富血小板血浆生物功能的发挥由于受到诸多因素的控制,使得富血小板血浆在相关的研究中出现有争议的结果,因此作者对其中可能影响的因素之一,即富血小板血浆的激活方式之凝血酶浓度进行研究。本实验在细胞实验基础上,把富血小板血浆的使用浓度固定在约为全血血小板的5倍,以β-磷酸三钙为载体,将促骨髓基质细胞增殖的最佳浓度60U/mL与常用浓度1000U/mL比较,用于激活富血小板血浆,再复合载体β-磷酸三钙用于修复新西兰兔的颅骨缺损。本实验结果提示,富血小板血浆有助于骨组织缺损的修复,但所使用的凝血酶浓度对骨组织修复再生并无影响。富血小板血浆常用的激活剂有凝血酶氯化钙混合溶液。在体外凝血酶的浓度可影响细胞的增殖、组织因子及炎症因子的释放,且一定范围内作用呈浓度依赖关系,高浓度时具有神经毒性,抑制细胞的增殖,甚至引起脑细胞死亡。相对于体外简单可控制的环境,体内环境比较复杂,凝血酶浓度是否会影响富血小板血浆用于体内组织的修复目前相关的研究尚罕见报道,体外促细胞增殖的最佳凝血酶浓度在体内不一定是促组织修复的最佳浓度。由于机体本身含有凝血酶,自体的凝血酶亦可激活富血小板血浆,因此猜测富血小板血浆在体内的应用,除可用外源性凝血酶激活外,是否也可直接植入体内,通过机体自身的凝血酶来激活,以释放其中的生长因子,尚需进一步的纵向研究。凝血酶激活的富血小板血浆很快即可释放表皮生长因子和血管生成素2等生长因子,而胰岛素样生长因子2的释放量并没有马上增加,这些结果均提示生长因子的释放、合成与降解机制各不相同,而不同生长因子促细胞增殖情况也不同。由于机体不同部位由不同的细胞占主导,创伤后修复再生所需的生长因子也各不相同,从而导致需要的富血小板血浆及凝血酶量的差别。骨组织的再生需要成骨细胞的活跃增殖,富血小板血浆不经激活也可促进成骨细胞的增殖。本实验中,术后3个月,单纯富血小板血浆复合β-磷酸三钙组新骨生成百分数显著高于60U/mL组、1000U/mL组和单纯β-磷酸三钙组,可能是由于自身的凝血酶已足够激活植入的富血小板血浆,而所加入的外源性凝血酶可能因为过剩而抑制细胞生长,从而影响组织的修复,但由于富血小板血浆释放的生长因子能够促进组织的修复,这种促进和抑制作用相互抵消部分,使得60U/mL组、1000U/mL组的修复情况优于单纯β-磷酸三钙组,却又差于单纯富血小板血浆组。而术后1个月单纯富血小板血浆组与60U/mL组、1000U/mL组间差别无显著性意义,可能与样本数量、个体差异等有关。由于本实验中凝血酶的浓度梯度是0,60,1000U/mL,0~60U/mL之间未设浓度,也可能最佳浓度在0~60U/mL之间。由于机体内环境的复杂性,富血小板血浆生物功能的发挥受很多因素的控制,实验中仅使用2个浓度,60U/mL和1000U/mL,结果发现凝血酶浓度不论在术后1个月还是3个月对新西兰兔颅骨缺损修复并无影响,可能与作者并未找到最佳的凝血酶浓度有关,关于凝血酶浓度对富血小板血浆修复组织的最佳浓度仍有待深入研究。0不同浓度凝血酶对富血小板血浆修复织物的影响许多生长因子参与了组织的再生与修复过程,富血小板血浆因其富含多种生长因子而越来越多用于组织修复的相关研究。关于富血小板血浆的功效,目前研究较一致的结论是富血小板血浆在体外能有效刺激细胞的增殖,如成骨细胞、内皮细胞、牙周膜成纤维细胞、骨髓基质细胞等,因此认为富血小板血浆能够促进组织的修复。生物机体是个复杂的环境,富血小板血浆生物功能的发挥受多种因素的控制,如个体差异,富血小板血浆的使用浓度、载体、激活方式等均可影响其功能。富血小板血浆是否能够真正促进组织的再生修复,目前的研究结果是有争议的。凝血酶常用于激活富血小板血浆,已有报道凝血酶浓度在体外可影响生长因子、组织因子等释放,但关于凝血酶在体内对组织修复是否具有影响,目前鲜见报道。本实验在细胞实验的基础上,拟用不同浓度凝血酶激活的富血小板血浆复合β-磷酸三钙,用于修复新西兰兔的颅骨缺损,通过组织学分析测量评价不同浓度凝血酶对富血小板血浆修复新西兰兔颅骨缺损的影响。16只大白兔均进入结果分析。术后1个月:各组缺损边缘较清晰,缺损周边有不同程度的新骨生成,β-磷酸三钙颗粒部