铜绿假单胞菌对肺组织的致病作用

铜绿假单胞菌对肺组织的致病作用

慢性呼吸道感染铜绿假单胞菌是一种具有很强抗病性的革兰阴性菌。它是医院感染的主要原因，也是气管插管和机械性通气的患者。在支气管扩张症、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化等患者中,其所致的慢性呼吸道感染也较常见。为模拟铜绿假单胞菌急慢性肺部感染和探索新西兰兔作为模型材料的可行性,我们采用经皮气管穿刺法接种铜绿假单胞菌,建立了兔铜绿假单胞菌肺部感染模型。1材料和方法1.1实验动物不符合临床中心健康清洁级新西兰白兔24只,兔龄6-10个月,体重2.0-2.3kg,雌雄不拘,由上海市公共卫生临床中心动物实验中心提供。临床分离的铜绿假单胞菌,经微生物自动分析仪及药敏鉴定,由上海长征医院呼吸科实验室提供。1.2试剂普通琼脂培养基;MH肉汤;0.9%灭菌生理盐水;戊巴比妥钠(德国分装)。1.3细菌培养和研磨CT(SomatomSensation16排螺旋CT),细菌培养箱,麦氏比浊仪,培养皿,组织研磨器。所有实验操作在上海市公共卫生临床中心P2实验室内完成。1.4动物饲养及处理(1)PA菌悬液的制备从临床支扩病人痰液中分离的绿脓杆菌,保存于4℃冰箱内。转种于琼脂培养基培养,挑取少许菌落放入MH肉汤中37℃孵育24小时,麦氏比浊法调制为1.5X108CFU/ml(相当于0.5个麦氏单位)的PA菌悬液。使用当天制备新鲜菌悬液。(2)实验动物的分组与处理24只兔随机分为实验组(A组)12只,对照组(B组)12只,分别编号后置于P2级实验室动物房内分笼饲养。经耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠lml/kg麻醉家兔。实验组用2ml一次性无菌注射器吸取1.5X108CFU/ml的菌悬液1.5ml,采用经皮气管穿刺法接种。两手指固定气管垂直进针,当回抽为气体并无明显阻力,快速注入菌悬液后立即将兔垂直取头高脚低位。对照组用同样方法注入l.5ml无菌生理盐水。所有兔均隔日施以处理因素。所有操作均在P2级实验室内完成。(3)处理后动物的喂养及观察处理后动物喂养方法相同,定期观察其生理状态、体重、体温及血象变化。(4)CT扫描接种当天于接种前所有兔行胸部CT扫描排除有病变兔,接种后隔日一次CT扫描观察病变。(5)标本处理实验组所有兔均待其自然死亡后取肺脏标本,于实验组最后一只兔死亡后处死对照组家兔。所有兔肺标本行肺组织匀浆菌落计数和病理检查(HE染色)。1.5统计方法采用SPSS18.0软件进行统计学处理。实验所得数据用均数±标准差表示,计量资料采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1模型的成功率实验组动物存活时间7-39天不等,平均存活时间为30.5天。除2只兔麻醉意外死亡,余所有兔均绿脓杆菌肺部感染。2.2息感冒,典型大件血压病A组新西兰兔早期有明显寒颤、发热、喘息急促、亢奋恐慌、毛发粗糙,后期出现反应迟钝、毛发黯淡、营养状态差,平均体重下降明显。B组新西兰兔未见明显异常。2.3血液图像变化经耳缘静脉采血,A组新西兰兔经处理后血白细胞总数显著升高,B组未见明显改变。2.4a组与b组菌落计数结果除实验组1只新西兰兔外,其余所有动物的细菌培养菌落计数在30-300之间,均符合标准。感染后28天,A组菌落计数均>105CFU/g;感染后35天A组菌落计数均>103CFU/g。A组计数均值(logCFU/g)为4.31±0.21,B组为0.54±0.07,A组计数显著高于B组(P<0.01)。2.5小鼠肺脏器及血管内皮炎及相关病变肺组织大体观察A组:注入PA菌液后第7天死亡家兔肺脏充血水肿,体积增大。第14天左右死亡家兔表现为肺脏充血水肿,肺组织表面出现较多的脓肿灶及出血点。第21天左右,部分家兔肺脏开始出现体积减小,纤维素性渗出,主要表现还是脓肿及出血灶(图1)。第28天时肺脏开始出现结节性及空洞性病变,部分出现肺大泡,出血及脓肿灶减小(图2)。第35天左右肺脏体积减小,质地轻度变硬。B组:注入生理盐水的对照组动物,肺脏大体标本外观无异常。镜下观察:A组PA菌接种后第7天左右肺泡腔内大量出血、渗出,中性粒细胞浸润(图3)。第14天左右肺组织内有小脓肿形成,肺泡壁小血管扩张充血,肺泡腔内渗出仍较明显(图4)。第21天左右部分肺组织内出现灶状凝固性坏死,实变伴周围肺组织代偿性肺气肿(图5)。第28天时细支气管壁炎细胞浸润,部分纤毛倒伏、脱落,部分出现肺泡II型上皮细胞增生及肉芽肿形成趋势(图6)。近第35天肺泡间隔开始增厚,部分增厚较明显,肺间质大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润,以淋巴细胞为主(图7)。B组动物肺脏镜下细支气管及肺泡结构正常,肺泡腔内未见炎性渗出。但其中1只出现轻度间质炎表现。2.6斑织物的ct检测A组有5只兔于接种后5天后出现单或双肺边界不清的斑片状阴影,后期所有兔均出现双肺炎症的CT征象,包括斑片状模糊影、片状实变、胸膜增厚等改变(图8、9)。B组胸部CT未见明显异常。3微生物的感染及其临床研究随着医疗技术的发展,各种侵入性操作和器官移植的推广,尤其是抗菌素的广泛应用和病原菌的变迁,革兰氏阴性杆菌已占院内肺炎病原菌的50%~80%,且病情危重,死亡率高,治疗困难。铜绿假单胞菌是革兰氏阴性杆菌中主要类别,属于条件致病菌,可引起医院获得性肺炎(特别是呼吸机相关性肺炎)、社区获得性肺炎及支气管扩张症、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化等患者中的下呼吸道感染,且其在抗生素治疗过程中极易变异而形成多重耐药,具有较高的死亡率。目前PA菌肺部感染发病机制、炎症反应特点、治疗药物药效评价等方面的研究较多,但对于PA菌早期肺部感染及由急性至慢性的病理演变过程相关研究及相关动物模型未见报道。为此,本研究使用经皮气管穿刺法注入PA菌接种至肺部,对PA菌动物模型建立方法进行探索,建立新西兰兔肺部感染模型,通过影像学动态监测病程进展,观察肺组织的病理学改变,为临床PA菌的诊治提供实验室依据。肺部感染模型的成功建立依赖于细菌学指标(肺组织匀浆菌落计数)和病理组织检查。本研究对感染后存活28天之内的新西兰兔行肺组织匀浆菌落计数和病理学检查,结果表明其菌落计数>105CFU/g,病理学检查表现为肺水肿、出血,中性粒细胞浸润,灶状脓肿形成,参照TANG,Pearson等定义的肺部感染模型建立标准,可判定为感染急性期。感染后35天的新西兰兔肺组织匀浆菌落计数>103CFU/g,病理学改变出现实变,肺泡间隔增厚,淋巴细胞浸润,部分有肉芽肿形成,为感染慢性期的表现。感染后28天至35天之间的新西兰兔肺部感染表现为急慢性混合形式。使用经皮气管穿刺法注入铜绿假单胞菌至新西兰兔肺部,可以成功建立新西兰兔急慢性肺部感染阶段模型,动态观察感染影像、病理演变过程,对肺部急慢性感染的在体基础研究提供了可行基础。国内外学者曾用免疫正常小鼠,通过气管插管接种PA菌的方法,成功建立了铜绿假单胞菌肺部感染动物模型。Cash等1979年首先报道了使用气管插管的方法将铜绿假单胞菌的琼脂包裹体接种至小鼠肺部,成功的模拟了小鼠肺部铜绿假单胞菌慢性感染模型。Lapae等应用叶支气管结扎并向支气管内注射绿脓杆菌的方法建立了小鼠慢性感染并发支扩模型。有学者使用免疫抑制小鼠接种或吸入粘液型PA菌,发现均能导致肺内急慢性炎症反应。但是上述肺部感染模型是通过创伤性较大的操作接种细菌至肺部抑或使用免疫抑制剂降低炎性细胞的活性来建立的。气管插管创伤性大且操作相对复杂,术后实验动物的生存率较低;免疫抑制后实验动物很容易感染其他病原微生物,并且生存周期相对较短,动物在免疫抑制状态下发生的病理改变和免疫功能正常的病理改变特征有一定差别。本研究与前述研究相比具有优化和创新,既避免了气管插管或免疫抑制导致的其他细菌真菌混合感染,保证了感染模型的单一菌种的纯度和可靠性,又简化了操作过程,降低了插管风险,提高了生存时间。经皮气管穿刺注菌法和其他接种方式比较,减少了气管切开和气管插管造成伤口感染出血等并发症,避免了雾化吸入对感染菌量的不精确控制的问题。本研究使用免疫正常的新西兰兔,通过经皮气管穿刺方式接种细菌,建立了稳定的PA肺部感染模型。在病理学和细菌学对肺部感染评价的基础上,以影像学作为病程监测和评价方式,可以动态、可视化、无创地观察铜绿假单胞菌肺部感染的早期至进展、急性至慢性的演变过程。本实验也存在一些不足之处。对铜绿假单胞菌肺部感染的影像学方面