天麻素对血管舒缩异常大鼠模型神经肽、一氧化氮系统的影响

天麻素对血管舒缩异常大鼠模型神经肽、一氧化氮系统的影响

目前，疼痛的研究主要集中在单一因素（csd）或疼痛的重要机制（三叉神经血管理论）。于生元等建立了清醒状态下血管源性头痛大鼠模型,部分解决了偏头痛反复发作问题。我们建立的血管舒缩异常大鼠模型,在一定程度上模拟了偏头痛发病中的血管不同形态。既往研究表明降钙基因相关钛(CGRP)、内皮素(ET)、β-内啡肽(β-EP)、P物质(SP)、一氧化氮系统在偏头痛发病中具有重要作用,但是其与血管舒缩的相关性目前不知。中医临床实践表明天麻素对偏头痛有良好的临床疗效,具有独特的优势。我们在前期研究发现在血管收缩或舒张的情况下天麻素对血流速度均有不同程度的持续上调作用。本实验在多巴胺(DA)、硝酸甘油(GTN)诱发血管舒缩异常大鼠模型的基础上,通过对偏头痛相关神经肽、一氧化氮系统的研究,探讨天麻素对其的干预作用,为临床应用提供实验依据。1材料表面1.1利华动物实验SPF级SD雄性大鼠50只,北京维通利华动物实验技术公司提供,许可证号为SCXK(京)2007-0001。分笼饲养于东直门教育部重点实验室(普通级)。1.2实验用试剂盐酸氟桂利嗪胶囊(批号080802087)由西安杨森制药有限公司生产,试验用剂量0.9mg·kg-1。天麻素片(批号08HB)由昆明制药集团股份有限公司生产,试验用大鼠剂量27mg·kg-1。盐酸多巴胺(DA)注射液(批号080409)由广州白云山明兴制药有限公司生产,实验用剂量为20mg·kg-1。硝酸甘油(GTN)注射液(批号20080627)由北京益民药业有限公司生产,实验用剂量为10mg·kg-1。0.9%氯化钠注射液(NS),批号为0806021W,北京双鹤药业股份有限公司生产,实验用剂量2mL·kg-1。1.3免疫药盒与免疫药盒碘[125I]降钙素基因相关肽(CGRP)放射免疫分析药盒,碘[125I]内皮素放(ET)射免疫分析药盒,碘[125I]P物质(SP)放射免疫分析药盒,碘[125I]β-内啡肽(β-EP)放射免疫分析药盒,均由解放军总医院科技开发中心放免所提供;一氧化氮(NO)检测试剂盒(批号lot0903-2,普利莱基因技术有限公司),A014-1一氧化氮合成酶(NOS)总的测试盒(批号20090317,南京建成生物工程研究所)。1.4仪器、仪器和检测设备300-100型CBI脉冲多普勒血流计(Triton技术有限公司),脉冲多普勒血流探头(Lumen:1.5mm,Figure:E,Freq:20MHz;IOWADOPPLERPRODUCTS,USA),多导生理信号记录仪(BIOPAC公司,主机为BIOPACSystemsMP100),LD5-2A型低速离心机(北京医用离心机厂生产),LGR10-4.2型低温高速离心机(北京医用离心机厂生产)、Sn-695B型免疫计数器(上海核所日环光电仪器有限公司生产)、723A可见分光度光度计(上海精密科学仪器有限公司生产)DR-HW-2型电热恒温水温箱(北京市医疗设备总厂)、CliniBio128C酶标仪、KIM软件(悦泰医药科(国际)有限公司)。数码凝胶成像系统(上海天能公司)。2实验方法2.1各组的给药及灌胃大鼠随机分为5组,每组10只,分别为溶媒组、DA组、模型组、盐酸氟桂利嗪组、天麻素组。各组给药6d,每日灌胃1次。盐酸氟桂利嗪组、天麻素组按各自相应浓度的溶液灌胃。溶媒组、DA组、模型组均每日灌胃三蒸水1mL·100g-1。研究过程遵循实验动物管理条例(1988年2号令)。2.2各组模型的建立各组在第7天灌胃后0.5h后开始戊巴比妥钠麻醉(50mg·kg-1),左颈总动脉插管测血压,右颈总动脉外套多普勒探头测血流,肢体连接心电导联电极,气管插管。溶媒组:先皮下注射(sc)等体积0.9%NS(0.2mL·100g-1),间隔45min后皮下注射等体积0.9%NS,观察60min。多巴胺组:皮下注射DA(20mg·kg-1),间隔45min后皮下注射0.9%NS,观察60min。模型组:皮下注射DA(20mg·kg-1),间隔45min后皮下注GTN(10mg·kg-1),观察60min。盐酸氟桂利嗪组、天麻素组造模方法与模型组相同。各组实验交叉进行,保证组间均衡,给药与观察者为同一人。造模过程进行血流动力学监测。2.3抗凝血浆及血清的制备各组在完成血流动力学监测后1h(即GTNsc后2h),取腹主动脉血2mL,注入含有7.5%EDTA二钠30μL和抑肽酶40μL的冰冷离心试管中,轻轻摇匀,低温离心机,4℃、3000r/min,离心5min,分离出1mL抗凝血浆(供CGRP、ET、SP、β-EP检测用);取腹主动脉血2mL,注入离心试管中(供NO、T-NOS、iNOS、cNOS检测用),静置0.5h,常温离心机,3000r/min,离心10min,分离出血清1mL,所有抗凝血浆及血清按编号放入-20℃低温冰箱中贮存、备用。取血后,即刻将动物断头处死,取脑,去除脑膜和血管,液氮罐中贮存、备用。2.4指标报告2.4.1cep、et、sp、s-ep2.4.2rt-pcr方法的检测c-fosmrna表达各组随机抽取3个样本(共15个样本)采用RT-PCR技术进行中脑c-fosmRNA表达检测。自液氮贮存罐中转移出组织块称重,用Trizol法提取总RNA,应用北京博迈德科技发展有限公司的PCR引物,扩增产物长度为466bp。以GAPDH作为内参照,以RT-PCR方法检测c-fosmRNA的相对表达量。RT条件:42℃,60min→70℃,10min;PCR条件:94℃预变性5min→94℃,30s→55℃,30s→72℃,45s,共35循环,最后72℃,10min。取PCR产物20μL在1.5%琼脂糖凝胶自动图像分析仪扫描,应用QuantityOne图象分析系统对RT-PCR产物进行分析,计算条带的积分吸光度(IA),IA值为平均吸光度×面积。2.5组间比较及数据处理采用SPSS12.0统计软件分析。正态计量资料用x¯±sx¯±s表示,组间比较(≥3)采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD法;方差不齐(P>0.05为方差齐)取对数及开方等数据转换或采用Games-Howell检验。计数资料用频数来表示,双侧检验,显著性水平P<0.05。3结果3.1各组et的比较DA、GTN诱发的血管舒缩异常模型大鼠神经肽的表达不一,与溶媒组相比,模型组ET含量降低(P<0.05),β-EP及SP含量升高(P<0.05)。与模型组比较,盐酸氟桂利嗪组、天麻素组ET表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05);多巴胺组、盐酸氟桂利嗪组、天麻素组β-EP含量均降低,差异有统计学意义(P<0.05);盐酸氟桂利嗪组SP含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。CGRP各组组间比较无统计学差异(P>0.05),但是模型组有升高的趋势。见表1。3.2模型组inos含量表达的变化DA、GTN诱发的血管舒缩异常模型大鼠各组TNOS、iNOS、cNOS比较差异没有统计学意义(P>0.05),但是与溶媒组相比,模型组iNOS含量表达有增多的趋势。各组NO组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。模型组NO较溶媒组表达升高,天麻素组NO含量较模型组减少,差异有统计学意义(P<0.05),而盐酸氟桂利嗪组表达虽减少,但差异没有统计学意义(P>0.05)。见表2。3.3各组大鼠c-fosmna的比较DA、GTN诱发的血管舒缩异常模型大鼠给予GTN后2h各组中脑c-fosmRNA比较差异有统计学意义(P<0.01),其中模型组表达增多,溶媒组、多巴胺组、盐酸氟桂利嗪组和天麻素组c-fosmRNA与其相比差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3、图1。4内镜存在的问题神经源性炎症(NI)是三叉神经血管学说(TVS)的主要内容。硝酸甘油甘油模型较好地验证了神经源性炎症在偏头痛头痛发作中的作用。结合GTN模型研究成果和以往研究基础,我们通过皮下注射DA,间隔45min再次注射GTN建立具有时相性特点的血管舒缩异常偏头痛大鼠模型,既可以观察药物对血管不同状态的影响,又可以验证其对神经源炎症的影响。本实验研究发现模型组ET含量降低(P<0.05),SP含量升高(P<0.05),而CGRP含量虽有增高的趋势,但是差异无统计学意义(P>0.05)。ET目前所知的最强的血管收缩剂,脑血管是ET-1最敏感的效应器官之一。在正常状体下,它与CGRP等物质保持一定的稳态,一般来说,ET-1释放量很低,主要维持血管系统的张力。该物质含量的降低表明血管舒缩处于一种“失衡”状态,可成为神经源性炎症的刺激因素,c-fos的激活可能与此有关。同时该研究结果与姚干等运用GTN诱导的偏头痛大鼠模型结果(GTNsc4h取材,颈部动静脉血)相一致。SP存在于初级感觉神经元,作为感觉信息的传递者在三叉神经系统内传递伤害传导,并且直接扩张血管,在血浆蛋白外渗(PPE)的形成过程中发挥重要作用。CGRP和SP共存于同一细胞中,两者可反映三叉神经节的活性。CGRP虽有增高的趋势,但与溶媒组比较却没有差异,与偏头痛发作其升高的现象不符合。考虑其原因有三,首先是取血时机的选择,CGRP受到刺激后在中枢的表达有一个时间进程,8h达到高峰,然后下降,48h恢复正常。本实验在注射GTN后2h取血,可能这个时间点CGRP表达没有增强。其次CGRP的代谢周期比较短,在人血液循环中生物半衰期为7～10min,如果在其代谢结束时取血,表达可能与溶媒组相似。最后取血部位的影响,临床CGRP相关研究取材部位一般为颈静脉血或肘静脉血及脑脊液,本实验取材部位为腹主动脉,该部位血中的CGRP可能已经降解。本实验研究发现模型组NO表达增多,iNOS含量表达有增多的趋势,但是与溶媒组相比差异没有统计学意义。NO可激活鸟苷酸环化酶(GC),升高细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)水平,抑制细胞Ca2+内流,降低细胞膜K+通道的活性,从而使血管平滑肌松弛。硬脑膜是头痛的主要疼痛结构,其粗大的动脉为硬膜中动脉,NO使其血管平滑肌松弛,在临床上表现为搏动性头痛。目前已发现3种NOS,分别是内皮细胞型NOS、神经元型NOS、诱导型NOS。前两者是钙依赖性的生理性NOS,iNOS是非钙依赖的病理性NOS。iNOS主要存在于巨噬细胞、肥大细胞、神经胶质细胞等,其基础状态下活性几乎可以忽略不计,但在脂多糖或细胞因子如γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等刺激下,活性明显增加。本实验发现模型组iNOS表达尽管有升高的趋势,但与溶媒组表达类似,与NO的升高不成比例。考虑原因由取材部位所引起。文献报道iNOS表达多在硬膜。故本实验的样本来源是腹主动脉血清,所以iNOS表达与溶媒组相似。β-内啡肽(β-EP)紊乱也是疼痛发生的主要原因。β-EP是主要来源于脑垂体,平时少量释放,在疼痛、中毒等应激状态下释放增加。β-EP含量的减少会导致“镇痛效应”的减弱引起头痛的发生,但是应激会导致β-EP的过度释放,导致脑组织的损伤。本实验发现模型组β-EP含量明显增多,其机制主要由应激所致。DA、GTN引起的血管剧烈舒缩,导致一些神经肽的内环境紊乱,促进β-EP释放增多。与有关报导相符合。β-EP增加具有开放钙通道、调节内皮素释放、抑制呼吸中枢介导CO2潴留致脑血管扩张、激活阿片受体等多种生理效应,在偏头痛中发挥着重要作用。Fos蛋白是c-fos基因的产物,调节着其他基因的转录,属于即刻早期反应基因。c-fos是神经元损伤激活的标志。Fos的免疫反应性为神经元亚群受到伤害性刺激和相关伤害路径判定提供了一个很好的鉴别方法。在偏头痛的疼痛路径中(导水管周围灰质、下丘脑)应用甚广。本实验采取RT-PCR技术对中脑c-fos表达进行检测,模型组表达增多,与溶媒组相比差异有统计学意义(P<0.05)。表明该模型在注射后GTN后2hc-fosmRNA表达开始增多,疼痛伤害路径开始激活。钙通道在整个偏头痛发病中具有重要的作用,其阻滞剂可能具有收缩血管平滑肌、干预皮层扩散的形成和扩散、干扰神经血管炎症等作用。本实验结果提示盐酸氟桂利嗪具有以下作用:(1)改善低ET状态,抑制过高的SP,降低过高的β-EP,使神经肽恢复稳态;(2)抑制c-fosmRNA的表达。表明盐酸氟桂利嗪对偏头痛的预防作用可能通过神经肽的调节、c-fosmRNA的下调发挥预防偏头痛作用。偏头痛属于中医“头风”、“脑风”等范畴,几千年的临