中医药治疗骨骼肌造血微环境研究进展

中医药治疗骨骼肌造血微环境研究进展

骨髓承载性微环境是骨髓血浆干燥的生存环境。经过更新，它可以产生大量的内部环境。它包括微血管系统、基质干细胞、细胞外基质和多种细胞因子。基质干细胞也称为间充质干细胞,在一定条件下可向成骨细胞、造血基质细胞、脂肪细胞等分化。细胞外基质有纤维连接蛋白、层黏蛋白和胶原蛋白等,而细胞因子则包括多种黏附分子、趋化因子等,共同协调造血干细胞的生命活动。造血细胞在微环境各种因素的调控下增殖、分化、发育及成熟。再生障碍性贫血、白血病等多种血液病涉及骨髓造血微环境的改变。因此研究骨髓造血微环境,对于阐明血液系统疾病的发病机理、改善治疗方案具有重要意义。近年来国内外学者对骨髓造血微环境的研究取得了较大进展,中医药治疗多种血液病具有一定的特色优势。本文就骨髓造血微环境及中药调控作用的研究现状综述如下。1相关因素包括骨髓血浆微环境的设计1.1不同照射条件对小鼠骨髓vegf表达的影响骨髓造血功能依赖于一个完整的微循环系统,骨髓微环境中微循环的异常可能影响造血干细胞(hemopoieticstemcell,HSC)的增殖和分化。而血管内皮生长因子(VEGF)是调控血管生成和造血的重要因子之一。有研究表明,VEGF基因敲除小鼠的HSC生存能力、集落形成和体内增殖率等均明显下降。GerberHP、Fureder等报道,再生障碍性贫血(AplasticAnemia,AA)患者骨髓微血管密度和VEGF的表达水平均明显低于正常对照组,而经HSC移植成功或免疫抑制治疗有效者,其骨髓微血管密度和VEGF表达水平均较治疗前明显增高,并伴随造血恢复而血清VEGF水平显著上升。张莉等比较22例AA患者及10例正常对照者骨髓微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)表达,也发现AA患者骨髓MVD明显低于对照组,并且重型AA患者的MVD较非重型AA更低,差异有统计学意义(P<0.01)。AA患者骨髓VEGF阳性细胞百分率明显低于对照组(P<0.01)。经免疫抑制治疗获得疗效的患者骨髓MVD及VEGF阳性细胞百分率均较治疗前明显增加,提示促进血管生成以及改善骨髓血液循环的药物在免疫抑制治疗的基础上或可加快造血恢复。张增利使用不同剂量的γ射线全身照射C57BL/6J小鼠,分别用逆转录多聚酶链反应和酶联免疫吸附法法研究,结果发现,对非照射组,随着骨髓基质细胞体外培养时间的延长,其VEGF在基因和蛋白水平表达都显著升高。受到5Gy或10Gy射线照射后,VEGF随时间变化的总趋势与非照射组相同。照射组培养6d,上清液中VEGF含量高于同时点的非照射组;而在第10天时,却显著低于同时点的非照射组。分析其原因是5Gy或10Gy射线先期引起骨髓基质细胞VEGF的表达增强可能是机体的一种代偿性反应,有利于机体造血的重建。但受到照射后培养10d的骨髓基质细胞数已显著低于非照射同时点的细胞数。杨龙等将6~8周龄雄性昆明小鼠随机分为正常对照组、全身照射组、全身屏蔽照射组以及左半身照射组,以8.0Gy60Coγ射线照射,观察小鼠外周血白细胞和骨髓有核细胞计数,检测血清SOD、MDA变化,用Westernblot和免疫组织化学结合激光共聚焦显微镜观察骨髓造血组织VEGF表达的改变。结果在半身照射条件下,小鼠外周血白细胞降低,未照射侧骨髓有核细胞计数减少,血清MDA升高,SOD降低(与正常对照组比,P<0.01);非照射区域骨髓造血组织VEGF表达明显减少,VEGF阳性细胞显著下降(与正常对照组比,P<0.01)。说明局部电离辐射作用后,可导致非照射区域骨髓造血组织增殖抑制,VEGF表达显著减少,氧自由基激活可能参与了该损伤过程。1.2细胞移植对常儿童及胎儿的影响骨髓基质细胞包括骨髓间质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)及一些较成熟细胞,如成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成骨细胞等,其通过分泌某些细胞因子调控HSC的生理功能。MSCs是一类具有向中胚层、外胚层及内胚层多种组织细胞分化能力的原始细胞。在体外、体内均可定向分化为成骨细胞和成软骨细胞,作为骨生成细胞的来源,MSCs是骨组织再生的细胞学基础。AA患儿骨髓来源的MSCs体外生长特征有别于正常儿童及胎儿骨髓来源者,培养早期与正常儿童及胎儿骨髓来源者有近似的增殖能力,但当扩增至20群体倍增值时,长期增殖能力即耗竭,而正常儿童和胎儿骨髓来源的MSCs却可稳定扩增至30群体倍增值。MSCs在造血干细胞移植中有多方面作用。它一方面促进造血干细胞植入并促使其沿多系方向分化;另一方面可发挥免疫调节作用,降低移植物抗宿主病发生率及严重程度。朱舜明等在体外对小鼠骨髓基质细胞进行培养、扩增,并将第三代细胞通过尾静脉移植到同种接受全身大剂量射线照射的小鼠体内,测定移植后不同时期小鼠外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(HGB)值,观测各组脾集落形成单位(colonyformingunit,CFU-S),探讨同种异体骨髓基质细胞移植对急性辐射造血损伤修复的影响。结果,经骨髓基质细胞移植小鼠的WBC、RBC、PLT、HGB在移植后15~20d较对照组明显增高,移植组脾细胞集落形成单位(CFU-S)明显高于对照组(P<0.01)。实验显示,同种异体小鼠骨髓基质细胞移植能促进小鼠造血干细胞在脾脏定居,增强造血干细胞形成集落的能力,并能显著提高外周血细胞数量,促进损伤后早期造血功能重建。有报道,体外进行人骨髓间充质干细胞原代培养后诱导为成骨细胞,构建二维培养体系,将免疫磁珠分选的CD34+脐血干/祖细胞接种于其中。结果发现:在所构建的造血干/祖细胞(HSPC)二维培养体系中,骨髓MSC诱导成骨细胞对于脐血造血干/祖细胞培养的支持作用显著优于其他各组培养体系,尤其对长期造血干细胞(longterm-HSC)体外生存有更为明显的支持作用。1.3sdf-1与cxcr4的互变关键作用骨髓MSCs通过产生和分泌多种细胞因子如干细胞因子(SCF)、粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF和b-FGF)、白细胞介素、胰岛素样生长因子(IGF)、β型转化生长因子(TGF-β)、基质细胞衍生因子(SDF-1)等对造血干、祖细胞的增殖、分化和发育起重要的调控作用。其中SDF-1是一种趋化因子,CXCR4是它的特异性受体。CX-CR4在造血细胞广泛表达,SDF-1/CXCR4信号缺乏可抑制胸腺细胞增殖和分化,SDF-1通过上调Bcl-2和下调Bax蛋白表达,增强T淋巴祖细胞生存。黏附分子是介导细胞间及细胞与基质间相互接触及结合的一类分子,其所介导的造血干、祖细胞与造血微环境中各种成分的黏附作用在造血干、祖细胞的迁移、循环以及增殖分化过程中发挥关键作用。造血干、祖细胞表面表达一定数量和种类的黏附分子,其相应配体在骨髓微环境中的内皮细胞以及细胞外基质等处表达。目前研究较多的与造血干、祖细胞归巢关系密切的黏附分子主要包括以下三类:整合素家族、免疫球蛋白超家族及选择素家族。骨髓基质细胞也表达多种黏附分子。骨髓基质细胞表达血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-l(ICAM-1)、血小板内皮细胞黏附分子-l(PECAM-1)、E-选择素(E-selectin)等。这些黏附分子既介导基质细胞与造血细胞之间的黏附,又介导细胞间的信息通讯。在不同发育阶段,造血细胞表面表达的不同黏附分子与基质表面相应的配体结合传递发育信息,一旦造血细胞发育成熟,就失去与基质细胞黏附的相应黏附分子而从基质层脱离。细胞黏附分子表达降低在慢性再生障碍性贫血的发病中发挥了一定作用,随着病情的缓解黏附分子表达增强,纠正再生障碍性贫血患者黏附分子的异常表达,可以改善其骨髓造血功能。2精血与人体中医学研究血液及造血系统疾病的历史悠久。《灵枢·经脉》载:“人始生,先成精,精成而脑髓,骨为干,脉为营……血气乃行。”即为前人对人体血液生理的认知,认为血生成始于精,血气成行赖于脑髓、骨、脉且与骨髓关系更为密切,故有《素问·生气论》“骨髓坚固,气血皆从”等之论述;若先天禀赋薄弱,或又后天饮食劳倦,失于调摄,致脏腑失调,精血不足则人体气血无法正常运行而变生诸病,故亦有《病源·虚劳侯》“虚劳之人,精髓萎竭,血气虚弱,不能充盈肌肤,故此羸瘦也”等等深刻的论述。随着中医血液病研究的不断深入,中医药治疗造血微环境相关血液病取得了良好疗效,并通过基础研究和实验研究等不断深入阐明作用机理。2.1川浚嗪对放射性小鼠骨髓中vegf表达的影响骨髓微血管系统是造血微环境的主要组成部分。放射损伤骨髓造血功能主要表现在微血管系统损伤。因而,骨髓微血管的修复、血流的重建是骨髓造血细胞生长所需要的营养物质及体液因子供应的保证,是促进造血细胞、基质细胞的生长发育和功能恢复的重要条件之一。陶氏等用60Coγ射线辐射小鼠建立骨髓微血管放射损伤模型,即时分别腹腔注射生理盐水或刺五加注射液及复方丹参注射液20~40mL/kg,每日2次,连续3d,辐射后第4天骨髓病理切片观察发现模型小鼠股骨骨髓毛细动脉血管数量、面积和造血组织容量百分率明显减少,而注射刺五加及复方丹参注射液组小鼠骨髓毛细动脉血管数量、面积和造血组织容量百分率明显增加,同时外周血RBC、WBC和Hb升高。采用蛋白免疫印迹(Westernblot)法、免疫组化法及流式细胞术,对放射损伤小鼠骨髓MSCs中VEGF蛋白表达水平、骨髓组织中VEGF受体胎肝激酶-1(flk-1)表达变化、MSCs凋亡率及细胞周期改变进行分析,并观察胃饲川芎嗪连续13d作用,结果发现,放射损伤后小鼠骨髓MSCs中VEGF和骨髓组织中flk-1表达均明显低于正常水平,虽然随时间推移表达水平可见逐渐升高,但照射后第14天仍未恢复正常;而川芎嗪组在第14天时已接近正常水平。放射损伤后MSCs停滞于G0/G1期,S期合成减少,凋亡率明显增加,第14天时仍未恢复正常;用川芎嗪治疗后,MSCs的S期合成活跃,凋亡率明显下降,第14天时恢复更明显,接近正常水平。骨髓切片苏木素-伊红(HE)染色也证实川芎嗪组小鼠造血恢复明显较对照组快。说明川芎嗪可促进MSCs中VEGF的表达,通过VEGF/flk-1途径改善放射损伤小鼠骨髓微环境,是其促进造血功能恢复的机制之一。将56只健康BALB/C小鼠随机分为3组:正常组:8只小鼠不做处理;照射组:24只小鼠经60COγ射线6.0Gy全身照射;当归注射液组:24只小鼠经60COγ射线照射后给予腹腔注射当归注射液2.5g/kg·d。在照射后第3、7、14天采用免疫组化法检测小鼠骨髓基质细胞血管内皮生长因子及其受体Flt-1的表达,并用流式细胞术检测相应时间的骨髓基质细胞凋亡率。结果当归注射液组照射后7、14d后骨髓有核细胞计数、血管内皮生长因子及其Flt-1受体表达明显高于照射组;当归注射液组照射后3、7、14d骨髓基质细胞凋亡率均明显低于照射组。结果说明,当归注射液可能通过促进骨髓基质细胞血管内皮生长因子及其受体表达,修复骨髓微环境。2.2体外培养对猪bmsc增殖的影响既往的研究表明,人参总苷对体外培养的骨髓造血干细胞及祖细胞有促进增殖作用,对骨髓造血因子具有促分泌作用。研究发现其对BMSC的增殖也有促进作用。将体外培养的BMSC分为对照组及实验组,实验组加入不同浓度的人参皂苷Rg1诱导培养,对照组加入等量培养基。结果显示,人参皂苷Rg1较对照液明显提高体外培养BMSC的成纤维样集落形成单位数(P<0.05~P<0.01),尤以(5~50)×10-7mol/L组为明显,在浓度为10-6mol/L时集落数即达高峰。在人参皂苷Rg1浓度为10-6mol/L时,其BMSC3H-TdR掺入率明显高于对照组(P<0.05~P<0.01),随着剂量的增加其促进增殖作用增强。用四甲基偶氮唑盐法测定BMSC光密度值,显示人参皂苷Rg1对BMSC增殖作用明显强于对照组(P<0.05~P<0.01),结果说明,人参皂苷Rg1体外培养对猪BMSC具有增殖作用,且具有剂量依赖性。10-7和10-8mol/L的淫羊藿苷作用48和72h体外诱导骨髓间质干细胞,发现其可促进骨髓间质干细胞增殖率及分泌血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)。应用MTT方法检测显示,长春新碱(VCR)5μg/mL培养14d具有明显抑制小鼠BMSC生长的作用,川芎嗪10、20、40μg/mL可促进BMSC生长且明显干预VCR对BMSC增殖的抑制。原代培养BMSC,随机分为对照组和当归多糖组。MTT法检测发现当归多糖浓度分别为50mg/L、100mg/L时明显促进小鼠BMSC的增殖;BMSC达80%贴壁所需时间比对照组明显缩短;流式细胞仪检测显示S期和S+G2/M期均较对照组明显增多;而G0/G1期细胞均较对照组明显减少;说明当归多糖可改变BMSC细胞周期,减少凋亡细胞数目进而促进BMSC的增殖。四物汤化学成分组方合可增强人BMSC系细胞的能量代谢;使处于G0/G1期的细胞显著少于空白组;增殖指数则显著大于空白对照组;具有明显促进人BMSC系细胞增殖作用。郭平等采用流式细胞术和蛋白质组学方法测定芍药苷对人骨髓成纤维样基质细胞系(normalhumanbonemarrowfibroblastoidstromalcellline,HFCL)细胞周期及蛋白质表达影响发现,芍药苷能促进HFCL由G0/G1期进入S期,能促进HFCL增殖,作用于HFCL多个靶点,促进细胞结构蛋白质的合成和蛋白质分子伴侣的表达,促进HFCL的能量代谢,抑制HFCL凋亡,间接发挥补血作用。CFU-F源于BMSC中的成纤维细胞,而成纤维细胞是分泌造血生长因子的主要基质细胞成分,CFU-F的数量可间接反映体内造血的微环境。实验显示小鼠受到2.0GyX射线照射后,CFU-F的数量明显减少,造血微环境受到损伤,预防灌胃给予松茸多糖400~1200mg/kg,每天1次,连续7d的小鼠与模型对照鼠比较,CFU-F数量明显增加,提示对成纤维细胞有一定的保护作用,可促进造血微环境的恢复且随着剂量的增加,保护作用更强。人参多糖和当归多糖可诱导人脐静脉内皮细胞株造血生长因子的活性及粒单系集落刺激因子(GM-CSF)、IL-3和IL-6在内皮细胞的表达,能上调造血微环境中的内皮细胞分泌造血生长因子来调节血细胞的生成。2.3红细胞输注护方式与骨髓造细胞的关系吴宁等取健康BALB/c小鼠,随机分为3组:正常组(不做处理),骨髓移植(BMT)+生理盐水组(简称生理盐水组)和BMT+川芎嗪治疗组(简称川芎嗪组)。生理盐水组和川芎嗪组分别胃饲生理盐水0.2mL/只和川芎嗪每次2mg/只,2次/d。在BMT后第7、14、21、28天处死小鼠,用RT-PCR和Westernblot方法检测BMSCbFGFmRNA及其蛋白表达水平。结果表明,BMT后第7、14、21天川芎嗪组和生理盐水组BMSCbFGFmRNA及其蛋白的表达均明显低于正常组(P<0.01或P<0.05),但川芎嗪组明显高于生理盐水组(P<0.01或P<0.05),到第28天,川芎嗪组bFGFmRNA及其蛋白的表达已恢复正常,而生理盐水组仍未恢复正常,两组之间有显著性差异(P<0.01)。结果表明,川芎嗪可能通过增加bF-GF的表达水平而促进骨髓微环境的修复,加速BMT后骨髓的造血重建。急性放射损伤小鼠骨髓组织中成纤维细胞生长因子(bFGF)表达显著低于正常组(P<0.05或P<0.01),胃饲生理盐水或川芎嗪13d。川芎嗪组bFGF、bFGFR(bFGF受体)的表达均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。川芎嗪可促进急性放射损伤后骨髓造血而促进骨髓组织中bF-GF、骨髓单个核细胞表面bFGFR的表达可能是其加速骨髓造血微环境的修复、重建机制之一。临床对造血调控因子表达测定发现,慢性再生障碍性贫血患者骨髓造血细胞调控干细胞因子、IL-3表达水平明显低于健康人组(P<0.01),采用补肾益髓中药治疗后升高(P<0.05);患者治疗前TNF-α、IFN-γ表达水平明显高于健康人组(P<0.01),治疗后降低(治疗组P<0.01,对照组P<0.05)。提示补肾益髓法中药可调节造血相关细胞因子,增强正调控因子的作用,解除过高的负调控因子对造血细胞的过度抑制而达到治疗目的。小鼠经2.0Gy60Coγ照射后第3天,腹腔注射环磷酰胺50mg/kg连续3d,可制备骨髓抑制模型。与正常组比较,模型组骨髓有核细胞对骨髓基质细胞的黏附能力显著下降,BMSC对层黏连蛋白(LN)、纤维黏连蛋白(FN)、焦点黏附激酶(FAK)表达量明显减少。给予四物汤配方颗粒2.5、5.0和10.0g/kg药液,共给药7d,明显促进LN、FN、FAK表达,并具有剂量依赖性。LN是细胞外基质(ECM)中非胶原性糖蛋白,是基底膜的主要活性成分;FN是骨髓间质的重要组成成分,通过与细胞表面受体整合素结合,介导细胞与细胞、细胞与基质间的相互作用;FAK是一个胞浆酪氨酸激酶,在整合素介导的信号传导途径中起着关键作用,介导细胞在ECM上的黏附和迁移。四物汤配方颗粒可通过对骨髓抑制小鼠造血微环境的改善,促进骨髓造血功能的恢复。已如前述,造血微环境对于骨髓干细胞的增殖和分化起着重要调控作用,BMSC是构成骨髓微环境的重要组成部分,基质为造血细胞提供一个定居、增殖、分化和发育的微环境。在造血干细胞、基质细胞和髓窦内皮细胞内有一系列黏附分子受体或配体。它们介导造血干/祖细胞与骨髓微环境密切接触和信息传递。黏附分子受体或配体之间的相互作用介导造血微环境对造血的调节,也影响着造血干细胞动员和归巢,对造血细胞的增殖、分化和自我维持发挥至关重要作用。ICR小鼠经60Coγ射线(3Gy,剂量率0.6,照射时间5min,距离4m)全身照射后,于第4~6天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg和氯霉素62.5mg/kg。正常对照组施行假照射(铅砖屏蔽),于第4~6天腹腔注射等体积生理盐水,以外周血象、骨髓象验证再障模型的建立。造模动物成模后分组,小鼠分别胃饲生理盐水、补肾化痰活血复方(熟地、何首乌、菟丝子、补骨脂、海浮石、山慈姑、五倍子、枳实、丹参、当归、赤芍、三七)28.6g/kg·d,每日1次,连续喂养14d后,采集骨髓进行BMSC培养,应用流式细胞仪检测BMSC黏附分子表达水平。结果表明,模型组小鼠BMSC黏附分子CD106、CD44、CD31表达水平均低于正常对照组,补肾化痰活血复方治疗后小鼠BMSC黏附分子CD106、CD44、CD31表达水平均明显提高,差异均有显著性。结果提示补肾化痰活血复方可能通过提高再障小鼠BMSC黏附分子CD106、CD31、CD44表达水平,从而增强造血细胞黏附定位于发育的骨髓微环境,改善骨髓造血功能。VCAM-1是一种重要的细胞黏附分子,主要表达于BM-SC、活化的血管内皮细胞等,在调节骨髓造血中有重要作用。有研究表明,在VCAM-1的启动子区域含NF-кB的结合位点,故VCAM-1的基因表达主要由NF-кB控制。NF-кB是一类关键性的核转录因子,它参与造血生长因子如IL-6、GM-CSF、CAM转录的调控,具有十分重要的功能。用P388瘤株制作荷瘤小鼠,并腹腔注射环磷酰胺、阿糖胞苷获得小鼠骨髓抑制模型,模型组给予生理盐水,药物组灌胃给予补虚化瘀方(由熟地黄、黄芪、女贞子、鸡血藤等药物组成)20g/kg,每日1次,连续用药12d。取股骨骨髓分别进行骨髓血管细胞黏附分子-l(VCAM-1)和核转录因子(NF-кB)定量测试和分析,发现模型组VCAM-1骨髓血窦的内皮细胞、基质细胞表达很少;补虚化瘀方组表达于基质细胞的VCAM-1明显增加,与模型组比较有显著差异,NF-кB的表达明显高于模型对照,同时用药组动物骨髓有核细胞培养产生的骨髓成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)计数也明显多于模型对照组。说明补虚化瘀方可刺激BMSC的增殖,保护BMSC免于化疗药物的损伤。基质细胞与造血细胞的直接连接有传递转换信息分子的作用,此种连接是通过基质细胞与造血细胞表面的黏附分子实现的,在众多的干细胞表面黏附分子中,CD49d是介导干细胞与骨髓黏附的最重要受体,它通过与VCAM-1、纤维连接蛋白(Fn)的结合介导干细胞与骨髓微环境的黏附,直接参与红系、B淋巴系的分化,并有利于骨髓造血细胞的增殖,90%以上的CD34+细胞都表达CD49d。VCAM-1表达于骨髓微环境网状纤维细胞和骨髓微血管内皮细胞上。VCAM-1在调节造血中有重要作用,参与造血细胞与基质细胞形成聚集体,有利于造血细胞增殖、分化。丹参素300mg/kg、川芎嗪50mg/kg腹腔注射给药,1次/d,连续给药7d。可显著增强小鼠骨髓造血细胞CD49d的表达,同时增加基质细胞VCAM-1的表达,说明丹参素和川芎嗪有可能通过作用于造血细胞和基质细胞,提高黏附分子受体和黏附分子配体表达,从而加强基质细胞与造血细胞相互作用,促进骨髓造血细胞的增生,参与造血干细胞的动员过程。造血干细胞的归巢是指造血干细胞通过静脉移植经外周血循环进入受体后在骨髓内的识