新基因的克隆

新基因克隆技术原理的概述摘要：新基因克隆是当今生物学最热点的领域之一，为能快速而准确地克隆目的基因，本文综述了一些基因克隆常用技术，包括功能性克隆，表型克隆，图位克隆，转座子标签技术，电子克隆等；通过从技术原理、适应性及使用例证等方面进行综述和评价，以便在实际研究中可以选用较为可行的方案。关键词：新基因克隆技术原理从上世纪70年代，由于以限制性核酸内切酶、DNA连接酶、逆转录酶的发现和应用及外源性DNA转化感受态E.coli.实验成功为标志的基因工程的出现，使人们可以在分子水平对目的基因进行克隆。根据“中心法则”遗传信息的流向，克隆新基因的途径主要分为正向遗传学途径和反向遗传学途径:前者主要通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行，而后者则是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。正向遗传学途径常见的方法如传统的功能克隆(functionalcloning)、表型克隆(phonetypicalcloning)包括递减杂交(substractivehybridization)、差异显示PCR(DD-RTPCR)、代表性差示分析法(RDA)、抑制性扣除杂交(SSH)等；而反向遗传学途径则以图位克隆(map-basedcloning)与转座子标签(transposontagging)技术较为常见,在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时，上述两种方法较为常用；同时随着现代生物信息学的发展，电子克隆(siliconcloning)出现，更为研究者提供了方便、迅捷的方法。功能性克隆(functionalcloning)1.1纯化后克隆若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因(1),除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能,利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用cDNA文库的筛选;或根据所获得的基因序列，指导5'端的引物合成，根据mRNA3'端poly-A序列指导合成poly-T的3'端引物，用PCR技术从制备细胞的mRNA或直接从胞浆内溶物物中合成相应cDNA,将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。1.2同源性克隆生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列，基于此原理，在其它种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列制备同源探针，经标记后从相应的文章中筛选阳性克隆，并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因,当然在没有全同源探针的情况下，可以使用部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。表型克隆(phonetypicalcloning)细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下(如癌变、异常增生)，常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高，而另一些基因可能表达降低或缺失，以下方法用来发现分化表达差异性基因：2.1交互差减差异RNA显示(substractivehybridization)由Lamar和Palmer(2在1984年提出，作为较早运用研究差异性表达基因的手段，其主要思路如下：主要过程如下:A•交互差减。分别提取具有差异表达的2种组织细胞A、B的mRNA,反转录为cDNA,并构建cDNA文库。将这2个文库进行交互差减得到A减B和B减A的2个差减cDNA文库，由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构，载体进入宿主后，其上质粒载体被切下，得质粒cDNA文库；A•差异显示。用3'锚定引物和5'随机引物对2个差减文库提取的DNA分别进行PCR扩增，将扩增产物用5%序列胶电泳，显示并分离差异条带，回收差异DNA，再次扩增后，获得富集的差异表达片段；•表达分析。采用反向Northern分析和Northern分析鉴定经再次扩增的差异DNA片段的真伪。反向Northern分析是将差异显示得到的扩增后DNA片段转膜，分别与来自A、B细胞系的总mRNA经反转录制备的32P标记的cDNA第一条链探针进行杂交，只与亲本来源细胞系杂交，而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因；A•对差异片段克隆、测序，并进一步分离获得差异表达的基因。2.2差异显示PCR(DD-RTPCR)1992年由PengLiang和A.B.Pardee等(3,4)率先使用，在核酸分子水平上显示了mRNA表达水平的差异。其主要原理是:以某组织或细胞的全部RNA或mRNA为模板，利用以3'端PolyA设计的锚定引物以及5'端任意引物进行逆转录反应和多聚酶链式反应 (RT-PCR),PCR扩增产物可在Sequence胶上显示该组织或细胞中的mRNA组成。被证实有差别表达的mRNA被回收，并重新扩增，扩增产物经克隆、测序后作为一个标记可被收入基因库并与基因库中的其他序列比较。该方法简便、灵敏，它能够快速地显示细胞mRNA的组成，可对各样本mRNA的差异同时进行比较和展示，并可立即进行cDNA测序、亚克隆、探针标记及文库筛选等工作；其缺点是假阳性条带多、对低丰度表达基因不易检测、基因克隆受mRNA表达时效影响、其扩增出来的条带常在基因3'端的UTR区，所提供的信息比较少。2.3代表性差示分析法(RDA)由Lisitsyn等1993年发明⑸，快速有效，可特异放大分化差异基因片段，达的基因，具体过程个如下:A•制备扩增子。提取TS和RS的mRNA并反转录制备双链cDNA即testercDNA和drivercDNA。然后用限制性内切酶切，将酶切片段装上接头，末端补平后，加入接头引物进行PCR扩增；•扣除杂交。去除接头后仅对tester片段加上新的接头，用过量的drivercDNA与之杂交退火，将形成三种产物:tester/tester、tester/driver、driver/driver；•特异性片段的扩增。末端补平后，加入新接头引物进行PCR。3种产物中仅自身退火形成的tester/tester两端均能和新引物配对而呈指数扩增，tester/driver仅一端可和新引物配对而呈线性扩增，Driver/driver无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸酶去除单链DNA分子，再进行PCR富集特异表达cDNA片段；A•对特异片段进行克隆，通过FISH等技术进一步分离特异表达基因。2.4抑制性扣除杂交（SSH）其依据的技术主要有两点（7,8）：消减杂交和抑制性PCR，利用链内退火优于链间退火，比链间退火更稳定，从而使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似于“平底锅”的结构,无法与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增；同时根据复性动力学原理，即浓度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于浓度低的单链cDNA,从而使原来在浓度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。其特点是：速度快、效率高，可同时分离几十或上百个差异表达的基因；假阳性率低,其阳性率高达94%;敏感程度较DD和RDA高，一些低丰度表达的cDNA可被检出；并可以大量特异扩增那些代表了有差别表达的cDNA片段，减少了实验结果的复杂性。1=12.5扩增的片段长度多态性技术（AFLP,Amplified1=1fragmentlengthpolymorphisms)在1992年，由Zabeau发明（9,io）,基本原理是基因组DNA双酶切的限制性片段的选择性扩增，主要程序是基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将所产生的限制性片段两侧分别连接一双DNA接头,接头与基因组DNA的酶切片段相连接作为引物结合位点，据此设计一系列3'末端含数个选择性碱基PCR引物，引物由核心序列(与人工接头互补)，内切酶位点特异序列和选择性核苷酸序列3'部分组成,PCR方法选择性扩增成套的限制性片段，可使目的序列扩增到0.5〜1g后，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段。AFLP技术作为一种功能强大的DNA指纹技术，与BSA(分群分析法)结合，可以找到与目的基因紧密连锁的分子标记，以AFLP所产生的整个基因组的标记为起点，通过染色体步行或更新的技术，定位克隆某些重要基因。而cDNA-AFLP(AFLP基础上的RNA指纹)则常用于从基因家族中分离高度同源性的基因而无需知道基因的序列，以及真核基因亚种间的不同基因和基因表达的时空性。AFLP可靠、灵敏，设计的专用引物3'端延伸出的1〜10个不等的随要核苷酸碱基，研究者可以通过选用不同数量的碱基调节AFLP产物的条带特异性和数量，获得更多的基因组多态性信息。2.6基因表达系列分析(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)技术0,12)细胞或组织的RNA逆转录为cDNA,分别使用锚酶及标签酶酶切，分离出每个cDNA上的标签(tag),经连接成双标签(ditag)，分析其组成，去除变形体后，经PCR扩增、酶切后，串联ditag,对照基因文库，查出不同tag代表的不同基因及可能的基因产物，如果在文库中无匹配的序列，就有可能发现了新的基因；同时还可利用SAGEtag的丰度确定基因表达丰度（13）。但是由于SAGE技术所得到的标签信息量少，对未搜索到的匹配序列的标签鉴定存在困难，因此该技术主要局限于GeneBank、EST数据丰富的生物,如人类、小鼠、大鼠等。2.7cDNA微阵列或芯片（DNAmicroarrayorchip）技术近年发展起来的又一新的分子生物学研究技术，其实验包括6个步骤：•将cDNA克隆加工为可供点印的材料；•将cDNA克隆（或寡核苷酸）点印到载体上；•样品RNA的分离（总RNA或mRNA）;•探针的制备（例如cDNA的合成和标记）;•标记的探针DNA与载体上的DNA杂交；•杂交结果的成像和图象分析。主要应用于：基因表达水平的检测（14）；通过比较组织细胞基因的表达谱差异，可以发现新的可能致病基因或疾病相关基因（15）；可进行基因点突变、多态性检测及染色体结构研究（16）。其最为主要的优点是：可自动、高效、同时检测目的材料中大量基因的表达情况并几乎可用于所有核酸杂交技术的领域。图位克隆（map-basedcloning）上世纪90年代初期图位克隆应运而生，成功的完成了诸如人NPCI等基因（17）的克隆，其大致原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DAN文库(如YAC、BAC或Cosmid文库)，构建出目的基因区域的物理图谱，再通过染色体步行(chromosomewalking)逐步逼近候选区域或通过染色体登陆(chromosomelanding)的方法最终找到包含该目的基因的克隆进而克隆该基因。定位克隆理论上适用于一切基因，但也存在应用上的一些不足:构建叠跨克隆群可能存在着困难；精细作图成本很高;定位克隆不能提供基因功能的相关信息，需借助其他手段。4转座子标签(transposontagging)技术俄)这是染色体上一段可以移动的DNA序列，它可以从一个基因座位转移到另一个基因座位,当转座子插入到某个功能基因内部或邻近位点时，就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型，通过遗传分析可以确定某基因的突变是否由转座子引起，由转座子引起的突变可用转座子DNA为探针,从突变株的基因组文库中钓取含该转座子的DNA片段，获得含有部分突变株DNA序列的克隆，然后以该DNA序列为探针,筛选野生型植株的基因组文库，最终得到完整的目的基因。该技术主要用于植物基因的克隆(19),由于可供利用的转座子的种类太少，而转座子在不同的植物中转座的频率和活性相差很大,并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体，限制了转座子标签法的应用范围。5电子克隆(siliconcloning)早在1991年，M.D.Adams(2。)首先运用表达序列标记(ExpressedsequenceTag,EST)以发现新基因，随着基因组计划的进展及EST数据库的迅速扩展，在克隆基因的全长cDNA序列以前，很有必要首先采用生物信息学的方法进行“电子”CDNA文库筛选(21,22)，以指导下一步的实验策略。对于已纯化的目的蛋白，首先可以经测定N-端相应的氨基酸序列，从氨基酸序列出发(23),证实dbEST中是否存在与待查询项完全相同或相似的ESTs，当查询到某一EST后，以该EST所在克隆的克隆编号作为查询项，以期获取对应于该EST的cDNA克隆的另一端的EST信息，为了进行电子cDNA库筛选，可以把通过以上方法获得的EST序列作为查询项通过BLASTN软件对dbEST进行搜寻，寻找EST重叠群，进而通过计算机程序获得基因的部分乃至全长cDNA序列并通过电子PCR的方法对其进行了染色体定位,而且可通过IMAGE协议索取相应的免费克隆，避免或减轻筛选全长基因的麻烦，以集中精力进行基因的功能研究。6前景展望基因克隆的技术发展很快，种类也越来越多,但每一种方法都有它的优势和劣势及适用范围和限制因素。综合来看，不同的克隆策略,虽主导思路不同，但常常是相互联系相互补充的，有些过程也是共通的，因而实验者必须根据所克隆基因的类型和实际条件选择最佳的方案。随着各种知识的积累，克隆基因的技术也逐步完善,速度效率也不断提高，相信人类终将掌握大规模、快捷、经济基因克隆的技术，并很快将基因的研究安全地应用到实践中去。参考文献：JosephSambrook,etal.〔M〕.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded:14.2-14.51.LamarEE,PalmerE.Y-encoded,spcies-specificDNAinmice:evidencethatthechromosomeexiistsintwopolymorphicformsininbredstrains〔J〕.Cell,1984,37:171-177.LiangPetal.DifferentialdisplayofeukaryoticmessengerRNAbymeansofthepolymerasechainreaction〔J〕.Science,1992Aug14;257(5072):967-71.LiangPetal.DistributionandcloningofeukaryoticmRNAsbymeansofdifferentialdisplay:refinementsandoptimization〔J〕.NucleicAcidsRes,1993Jul11;21(14):3269-75.LisitsynN,WiglerM.Cloningthedifferencesbetweentwocomplexgenomes〔J〕.Science,1993,259:946〜951.BowlerLD.RepresentationaldifferenceanalysisofcDNA〔J〕.MethodsMolMed,2004;94:49-66.GUOXin-hong,JIANGXiao-cheng,PANXiao-ling,CHENLiang-bi,ZHOUGuang-qia.SSHMethodandItsApplicationinGeneCloning〔J).ACTALASERBIOLOGYSINICA,2001(10):236〜238.〕RebrikovDV,DesaiSMetal.Suppressionsubtractivehybridization〔J).MethodsMolBiol.2004;258:107-34.ZabeauM,VosP,1992,EuropeanPatentApplication924026297(Publicationnumber:0534858A).VosPetal.AFLP:anewtechniqueforDNAfingerprinting〔J).NucleicAcidsRes,1995,Nov11:23(21):4407-14.VelculescuVE,ZhangLetal.SerialAnalysisofGeneExpression〔J).Science,1995,Oct20;270(5235):484-7.VelculescuVEetal.Tantalizingtranscriptomes-SAGEanditsuseinglobalgeneexpressionanalysis〔J).Science,1999,286:1491〜1492.JungSH,LeeJY,LeeDH.UseofSAGEtechnologytorevealchangesingeneexpressioninArabido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