《生物化学》第10章复制

DNA的生物合成(复制)DNABiosynthesis，Replication

第十章CentralDogma描述遗传信息流动的方向1958年F.crick逆转录酶1970年对中心法则进行了补充复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA第一节复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication

一、半保留复制的实验依据和意义子链继承母链遗传信息的几种可能方式

全保留式半保留式混合式密度梯度实验

DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。二、双向复制复制中的放射自显影图象A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。真核生物5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’三、复制的半不连续性3

5

3

5

解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。

领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

DNA复制的酶学TheEnzymologyofDNAReplication第二节参与DNA复制的物质底物(substrate):

dNTP聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):

解开成单链的DNA母链(ssDNA）引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白质因子一、复制的化学反应

(dNMP)n

+

dNTP→(dNMP)n+1

+

PPi

聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3

方向进行。二、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase,DDDP)简称：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性5´

AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´

3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-pol

Ⅲ功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）复制产生短片断的DNA323个氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA-pol

Ⅱ（120kD）

DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。

功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)复制产生长片断的DNA（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读

（二）复制的保真性和碱基选择（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。（二）复制的保真性和碱基选择•DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。•嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制

四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

（一）解螺旋酶和单链DNA结合蛋白解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整108局部解链（二）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

解链过程中正超螺旋的形成拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制

五、DNA连接酶连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。

DNA连接酶(DNAligase)作用方式HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能（一）复制的起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成

E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···

11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列5

3

5

3

1.DNA解链1）复制起始点的识别2）解螺旋酶解开双链4）SSB参与维持DNA的单链结构的稳定3）DNA拓扑异构酶(可能主要是II型酶的作用)，在将要打结或已打结处作切口。

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓扑异构酶SSB3

5

3

5

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

2.引发体的形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

引物酶复制是在一段RNA引物的基础上进行的，催化引物合成的是一种RNA聚合酶，它不同于催化转录过程的RNA聚合酶，因此称为引物酶。

DDRP——DNAdependentRNApolymerase由于DDDP不可以催化两个单dNTP之间的反应，DDRP可以催化两个NTP起始合成小的RNA片断引物酶合成的小的RNA片断称为“引物”，为DNA的合成提供3’－OH3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，在电子显微镜下均看到伸展成叉状的复制现象，称为复制叉。在DNA聚合酶III的作用下，新链第一个脱氧核苷酸就加到引物的3’-OH末端上，形成磷酸二酯键。复制开始。（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol领头链的合成：DDDP沿着模板3’5’滑动，第一个进入配对的dNTP与RNA引物上的3’－OH形成3’,5’－磷酸二酯键，留下3’－OH继续合成随从链的合成——岡崎片段的形成两条链是在同一个DNA-polⅢ的催化下进行延长的过程阶段一阶段二阶段三阶段四原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriterE.coli8232ori

terSV40500（三）复制的终止5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA连接酶随从链上不连续性片段的连接复制过程简图哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成

•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。•真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。•增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）复制的终止5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

端粒(telomere)是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。结构特点•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…功能•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成端粒酶的催化延长作用爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工端粒维持着染色体的稳定。端粒因细胞分裂而变短到一定程度时，细胞就会死亡。端粒破损会导致DNA变得脆弱、容易发生变异，可能导致一些与衰老有关的疾病，如动脉硬化和某些癌症。

逆转录和其他复制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四节逆转录酶(reversetranscriptase)逆转录(reversetranscription)RNADNA

逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶

逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA模板逆转录酶

DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA逆转录酶有三种酶的活性：RNA或DNA作模板的dNTP聚合酶活性和RNase活性

逆转录酶

AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。

试管内合成cDNAcDNA

complementaryDNARNA模板逆转录酶

DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA整合宿主DNARNA病毒在细胞内复制成双链的DNA，称为前病毒，前病毒可以独立繁殖在某些条件下，前病毒的基因组通过基因重组，参加到细胞基因组内，并且随着宿主的基因一起复制和表达——整合前病毒独立繁殖或者整合，都可成为致病的原因反转录病毒细胞内的复制二、逆转录研究的意义

逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

滚环复制(rollingcirclereplication)三、滚环复制和D环复制

是某些低等生物的复制形式，如

X174和M13噬菌体等。3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滚环复制5'

5

3

3

5

dNTPDNA-pol

γ

D环复制(D-loopreplication)

是线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的复制形式。

DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)andRepair第五节遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdamage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。

一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础

二、引发突变的因素物理因素:紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV紫外线照射可引起核酸链上相邻的两个胸腺嘧啶形成二聚体TT（胸腺二聚体）。化学因素三、突变的分子改变类型错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。

2.颠换（一）错配镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CTCGAG基因（二）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DN