梨上分离链格孢菌的形态学研究

梨上分离链格孢菌的形态学研究

梨果实的黑色斑点是一种重要的储存期疾病。水果表面上有几乎圆形或不规则的黑色斑点，中间塌陷。潮湿期间，病斑表面出现黑色霉菌层，影响水果的质量和商品价值。2004年美国和加拿大曾以中国出口鸭梨上发现链格孢新种(Alternariayaliinficiens)为由暂停中国鸭梨出口。为进一步研究我国梨上的链格孢种类,为控制黑斑病提供科学依据,同时比较研究其他国家梨上的链格孢,防止具危险性的链格孢菌传入我国,本文作者于2007年收集了河北部分鸭梨果园冷库中储存的具链格孢侵染症状的果实,并从市场上购买了部分其他品种的表面具黑斑症状的梨进行病原菌分离鉴定研究,试图从病原形态和分子生物学方面进一步明确引起鸭梨黑斑病病原菌的种类,并分析比较部分国家梨上的链格孢和我国梨上链格孢的种类差异。1材料和方法1.1日本梨酒的制备从河北部分果园的冷库中收集到表面有黑斑症状的鸭梨60余个,另从北京市场上购得表面有腐烂症状的新疆库尔勒香梨15个,从香港购美国梨(品种:d’Anjou)40个,从美国购买的产自智利的表面有腐烂症状的梨(品种:Conference)8个,从香港购买的日本梨(品种:20世纪)19个,分别从果实上分离病原菌。在梨上病斑周围的病健交界处及果柄表面用70%酒精擦洗消毒,用解剖刀去除表皮,取果肉腐烂部分平铺在滤纸培养基上;取果柄靠近基部的一段纵向剖开后在滤纸上均匀摆好。置于培养箱中,12h光照,12h黑暗,并在25±0.5℃的条件下培养3～5d。将出现链格孢菌的培养皿置于实体显微镜(50倍)下观察,用解剖针挑取具有典型产孢结构的单根孢子链上的孢子转接于马铃薯-胡萝卜培养基(PCA:马铃薯200g,胡萝卜200g,琼脂15g,蒸馏水1000mL)平板上。将平板置于上述光照和温度条件下培养5～7d。1.2材料和培养基分别挑取上述菌落的单个孢子,转入以下4种培养基上:马铃薯胡萝卜培养基(PCA)、1/2马铃薯胡萝卜培养基(1/2PCA)、干草培养基(HAY)和V8培养基(V8)上培养,于22℃左右、两支40W冷白光(4200k)灯管、8h照射和16h黑暗交替进行培养,灯管距离培养物约40cm,培养物面向上,培养1周后观察。链格孢的培养特性和鉴定在上述4种培养基上进行。将上述培养物在实体解剖镜50×下观察产孢表型。先根据Simmons和Roberts的描述确定培养物的产孢表型组,然后再鉴定种。1.3系统发育关系从每组产孢表型中分别选取4～10个菌株,共28支菌株进行5.8SrDNA及ITS区序列分析。另从GenBank上下载了20个Alternaria不同菌种的ITS序列进行系统发育关系分析(表1)。供试菌株在PDA平板上培养3～5d后,从菌落边缘取菌丝块并进一步切成极细的小块,移到50mL马铃薯-葡萄糖培养液中,25±0.5℃条件下摇床150r/min震荡培养2d,经滤纸抽滤菌丝,用无菌水冲洗3次后,用灭菌吸水纸吸去多余的水份,置于-20℃冰箱中保存备用。1.3.1总dna提取CTAB(CetyltriethylammoniumBromide)法。1.3.2增强糖体基因sacdaPCR反应体系:10×PCR缓冲液5μL、dNTP2.5mmol/L1μL、引物10mmol/L1μL、Taq酶1U、模板DNA0.1μg,加双蒸馏水至50μL。空白对照不加任何DNA模板。选用王洪凯等报道的1对引物ITS1和ITS4扩增核糖体基因ITS1-5.8SrDNA-ITS2区,正向引物ITS1序列为5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;反向引物ITS4序列为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。扩增程序:94℃变性5min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,35个循环;72℃延伸7min。1.3.3系统发育分析PCR产物由上海博亚生物技术有限公司测序。将测得的序列与GenBank下载的部分链格孢菌的基因序列(表1)一起,用ClustalX1.8软件进行比对,采用邻近-连接法(Neighbour-Joiningmethod)构建系统发育树。在最大简约树(树集)搜索中,采用启发式方法搜索最佳系统树,所有特征被认为是等权和无序的;同时,在分析前排除非简约信息位点。Bootstrapping用于评价各节点的支持率,测试中重复1000次。1.3.4genefot1和akt2的构建根据GenBank中发表的AK毒素合成酶基因序列(AccessionNo.AB015351AlternariaalternatageneforAKT1,completecds),合成了两条引物AKT-1和AKT-2,对产孢表型属A.gaisen组的5个菌株进行PCR检测。引物序列AK1:5’-AGCAGGAACAGCCGTATC-3’,AK2:5’-ACAGGGGCAACTTGAAAC-3’。反应条件:95℃5min;95℃15s,50℃45s,72℃45s,35个循环;72℃延伸5min。2结果和分析2.1分离结果表明病原菌分离结果见表2,其中分离到链格孢Alternaria115支。2.2芽孢杆菌回复突变株的构建在控制条件下对115支链格孢菌株进行产孢表型实验观察。产孢表型的分组标准参照Simmons的方法。产孢表型观察结果为115支菌株分属以下4组产孢表型。第2组(A.gaisen组):菌落在V8和HAY上致密,在PCA和1/2PCA上相对稀疏。孢子链直立,不分枝或基本不分枝,多数孢子链含5～9个孢子,分生孢子短卵形或长卵形。第4组(A.alternata组):菌落在V8和HAY上致密,在PCA和1/2PCA上相对稀疏。孢子链短,分枝频繁,主枝不明显,每条分枝含5～10个孢子,分生孢子倒棍棒形、卵形。第5组(A.tenuissima组):菌落在V8上致密,在另3种培养基上相对稀疏。孢子链长,直立,不分枝或基本不分枝,多数孢子链含孢子10个以上,最多可达34个,分生孢子倒棍棒形、长椭圆形。第6组(A.infectoria组):菌落在1/2PCA上稀疏,在另3种培养基上都较致密。孢子链直立,分枝不频繁,主枝不明显,每条分枝含5～10个孢子,由于孢子的假喙长,孢子链上的孢子之间看上去“间隔”很大。孢子倒棍棒形、卵形、长或短椭圆形。产孢表型观察未见第1组(Brevicatenate组)、第3组(A.aboresence组)和第7组(A.yaliinficience组)的形态。结果详见表3。观察产孢表型后,从第2组和第6组随机选4支菌株,从第4组和第5组随机选10支菌株,共28支菌株观察分生孢子形态,测量分生孢子大小。结果如下:第2组菌株孢身12.2～35.0μm×5.8～14.5μm,平均21.6μm×10.3μm,喙呈短柱状或锥状,2.0～8.7μm×2.3～4.6μm,平均4.1μm×3.7μm,孢子的横隔膜数为1～4,纵斜隔膜数为0～3。第4组菌株孢身11.3～31.0μm×5.2～15.0μm,平均21.5μm×10.3μm,喙呈短柱状或锥状,1.8～7.9μm×2.3～4.5μm,平均4.0μm×3.7μm,横隔膜数为1～4,纵斜隔膜数为0～3。第5组的分生孢子较长,倒棍棒形、卵形或长椭圆形,孢身23.2～47.1μm×6.6～14.7μm,平均29.3μm×10.5μm,假喙4.1～12.5μm×2.3～4.7μm,平均6.7μm×3.6μm,横隔膜数为1～6,纵斜隔膜数为0～4。第6组孢子倒棍棒形、卵形、长或短椭圆形,孢身14.4～51.0μm×5.6～16.3μm,平均27.7μm×11.4μm,假喙6.1～23.5μm×2.2～4.7μm,平均10.2μm×3.5μm,孢子横隔膜数为2～7,纵斜隔膜数为0～5。根据Simmons等和张天宇对Alternaria属种形态的描述,将第4组的菌株鉴定为Alternariaalternata(Fr.)Keissler,将第5组的菌株鉴定为Alternariatenuissima(Fr.)Wiltshire,将第6组的菌株鉴定为AlternariainfectoriaE.G.Simmons。第2组菌株的产孢表型虽出现Alternariagaisen的特征,但其分生孢子形态与A.gaisen明显不同,而与A.alternata相一致,是否为A.alternata的产孢初期阶段尚需进一步研究。2.3生物鉴定2.3.1最佳系统发育鉴定通过测定28支供试菌株的部分ITS区序列,结合从GenBank中下载的20条序列,用PAUP4.0b10软件进行系统发育关系分析,构建邻接树。在521个碱基中,共有56个简约信息位点。简约树步长为97,一致性指数CI=0.7938,保留指数RI=0.9078(排除非简约信息位点)。结果显示,所有待测菌株与已知小孢子种A.alternata、A.tenuissima、A.longipes、A.pomicola和A.gaisen构成了一个稳定的分支,与其他分枝发生明显的分化,说明待测菌与小孢子种之间的亲缘关系很近。从上述系统发育分析可以看出,Alternaria大孢子种彼此间及大孢子种与小孢子种间已发生明显分化,可以根据ITS序列差异明确区分。而供试的多数小孢子种在ITS序列上差异很小,因而不能根据ITS序列差异来区分小孢子种。2.3.2阳性对照,阳性对照两对引物对第2组菌株的PCR结果都为阴性,而阳性对照为阳性。这一结果说明被检测的菌株中没有梨黑斑链格孢(AlternariagaisenK.Nagano)。3反应型、致病材料及相关菌株的形态鉴定与系统发育研究在所分离到的115支Alternaria菌株中,A.alternata和A.tenuissima占绝大多数,分别为35.7%和53.9%,这两个Alternaria种广泛存在于死亡的植物组织甚至土壤和空气中,可以引起储藏期果实的腐烂。这一点,我国鸭梨、香梨和美国、智利梨的分离结果基本一致;日本梨上的分离物多为毛壳菌(Chaetomiumsp.),而链格孢较少,这一现象与其他国家梨的分离物不同,可能是在运输或储藏过程中污染所致,也可能是日本梨果实表面的微生物群落与其他国家和地区存在一定差异,有待深入研究。对于Alternaria小孢子种的分类,目前国际上有两种不同的理论。Simmons等提出以体视镜下的立体产孢结构,即产孢表型作为区分小孢子链格孢种的重要依据。日本的Nishimura和美国的Peever等学者通过对梨黑斑病和柑橘褐斑病的研究后提出,小孢子链格孢菌在形态上相似,其分生孢子的量度在统计学上属于一个A.alternata的复合种,因此主张将这些链格孢命名为A.alternata的不同致病型。我们的形态学研究严格按照Simmons等建立的方法进行,包括培养基、培养条件、培养时间、产孢表型等,多次重复实验表明,通过产孢表型和分生孢子的形态是可以将不同Alternaria小孢子种区分开的。在形态学研究时,有少量菌株出现第2组的产孢表型,但其孢子形态与A.gaisen不符,而与A.alternata一致。寄主专化性毒素(AKT)基因检测不支持这几支菌株是梨黑斑链格孢(A.gaisen)。这几支菌株是否为A.alternata还需进一步研究。另外,形态鉴定中属于A.infectoria的4支菌株在ITS序列分析中与其他待测菌株和已知小孢子种,如A.alternate,A.tenuissima,A.longipes,A.mali和A.gaisen之间构成了一个稳定的分支,且分别获得了99%和95%Bootstrap的支持,而未归入A.infectoria分支,这一结果可能是实验或分析过程中误差所致,需要进一步研究。分子生物学方法越来越多地被应用于真菌系统学研究和分类鉴定,其中核糖体RNA基因(rDNA)序列分析已被广泛应用于真菌的系统学研究,尤其是内转录间隔区(ITS)序列分析适用于种级水平的分类研究。国内外许多学者用ITS序列分析进行