双足并趾畸形患儿的先天性并指及相关基因的分析

双足并趾畸形患儿的先天性并指及相关基因的分析

指以异常足部发育为主要症状的遗传疾病，为常染色体显性遗传。临床上可分为五种类型：、、、和。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型先天性并指分别定位于2q34~36、2q31~q32和6q21~23.2。并指伴多指(synpolydactyly;SPD)为Ⅱ型并指(syndactyly,typeⅡ),通常情况下多为第3、4手指和第4、5脚趾受累,两指(趾)间由蹼相连接,不能分离。本病与其他亚型并指(趾)的不同之处在于,可出现多指(趾)。肤纹检查可见手掌纹理异常,掌褶线断裂。目前认为本病致病基因为HOXD13,定位于2q31-q32。在本研究中,我们对湖南怀化地区一出生后即发现双手并指,双足并趾畸形患儿的常染色体显性遗传先天性并指多指家系进行了连锁分析,表明其与Ⅱ型并指基因所在的区域紧密连锁,对HOXD13基因序列分析未发现突变。1材料和方法1.1病例对照及分析病例来源、家系情况病例由湖南省怀化地区卫生学校提供,为一先天性并指多指家系。该病已在家系中传递了4代,先证者曾祖母为首发病例。我们对该家系中的42名成员进行了分析,其遗传关系经亲属确证,调查前每位成员都做到了知情同意。1.2提取的dna用酚-氯仿法从外周全血抽提基因组DNA。1.3连通性分析1.3.1温度和时间对聚合酶活性的影响5μl反应体系,含50ng模板DNA,2.5mol/LMgCl2,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),50mmol/LKCl,每种dNTP250mmol/L,每引物0.625pmol/L,和0.25UHotstarTaqDNA聚合酶(QIANGENGmbH,Hilden,Germany)。反应采用Perkin-Elmer9700热循环仪。采用标准Touchdown程序:95℃预变性12min;touchdown循环14次,95℃变性30s,复性温度由63℃起始,以后每个循环递减0.5℃,直到56℃,72℃延伸90s;之后保持复性温度为56℃,1min,再进行30个循环;最后产物72℃延伸10min。1.3.2双核苷酸微卫星标记ABI公司连锁图谱2.0版。本套荧光标记物为400个从Ge′ne′thon人类遗传图谱中选择的多态性双核苷酸微卫星标记。每对标记物间距为10cM。1.3.3胺凝胶电泳用ABI377DNA测序仪进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳,连锁分析应用LINKAGE软件(Version5.10),外显率95%,疾病基因频率设为0.001。男女两性重组率相等。1.4突变检测1.4.1寡核苷酸体外扩增作为摸板的基因组DNA来自Ⅱ-10及Ⅲ-16和两名正常对照Ⅲ-14、Ⅲ-15。使用5对合成的寡核苷酸引物,对目的基因的两个外显子及其相邻内含子序列进行体外扩增。总反应体积为35μl,采用标准Touchdown程序(同上)。1.4.2pcr产物的测量序列PCR产物经纯化后,用ABIBig-DyeVer2.0试剂盒进行循环测序反应,利用ABI377型DNA测序仪分析。2双侧对称畸形家系中有16名成员患病。先证者Ⅳ-5,女,2岁。患儿出生后即发现双手并指,双足并趾畸形。X线显示双手3/4指并指,双足4/5趾并趾,指(趾)间由软组织相连。并指均呈双侧对称畸形。部分患者同时出现双手4/5指并指,或双足小趾多趾(图1)。两点连锁分析在Ⅱ型并指基因座2q31~q32发现紧密连锁(表1)。在D2s2314和D2s2310两引物处最大两点间LOD值为6.78。多点连锁分析最大LOD值为7.02。本家系单倍型分析遗传区间从D2s2302到D2s315之间,间距为20.61cM(图2)。HOXD13基因位于连锁区间之内。序列分析在HOXD13基因编码区、内含子-外显子交界区域,或启动子区域未发现突变。3hoxd基因重组并指伴多指(Synpolydactyly;SPD)是一种罕见的常染色体显性致病基因引起的肢体发育异常。该型并指(趾)畸形表现为手部3、4指的并指,通常伴蹼中第4指的全部或部分多指畸形,足部第4、5趾并趾及第5趾的多趾畸形。临床上有手部畸形的患者常伴有异常的掌纹。1927年,Thomsen对本病进行了详细的描述,随后相继发现了一系列患有并指(趾)的大家系。其中最重要的是1995年Sayli在土耳其发现的一个完整的大家系。该家系共有7代,其中病人182人,这显然是由于奠基者效应所引起的。同年Akarsu详细描述了这一罕见的大家系的临床表现。通过对这一罕见家系的遗传学研究,Sarfarazi将SPD遗传基因座定位于2q31,间距为1.7cM。这一结果提示HOXD同源基因簇中的基因突变有可能是导致SPD的原因。其中发生在HOXD8基因处的重组排除了基因簇中3′端方向基因致病的可能性,5′端方向的基因,特别是HOXD13、EVX2、DLX2、DLX1则很有可能是本病的致病基因。随后,在其他家系中的工作进一步证实了这一遗传基因座。1996年,Akarsu对Sayli报道的家系的遗传学分析,在HOXD13基因产物中发现一24个多聚丙氨酸的重复。正常人的HOXD13基因在翻译起始位点下游145bp处,编码一段15个丙氨酸的肽段,而在纯合子病人中由于碱基的插入,这一肽段延长达24个丙氨酸。之后,在其他的家系中也在HOXD13基因中发现了9个多聚丙氨酸的插入,证实了HOXD13基因的突变是导致Ⅱ型并指的原因之一。HOXD基因是由13个同源基因构成的一同源基因簇,它属于同源异型基因簇(Hoxgenecluster)中的一种。Hox基因簇在发育上十分古老,动物发育过程中它对肢体形态的形成有着重要的调节作用。Hox基因簇编码一系列转录因子,在发育中将不同的定位信息传送到肌体不同部位,使得肌体各部位能够各自独立而又协调地发展。HOXD基因簇中的9个同源基因(HOXD1,-D3,-D4,-D8,-D9,-D10,-D11,-D12,-D13)根据其距着丝粒的远近,按由远到近的顺序在染色体上依次排列。其上游近着丝粒方向,依次排列着EVX2基因和7个保守的调控元件。Kmita通过定位重组的方法,对小鼠体内HOXD基因簇中的基因和其上游的调控元件分别进行敲除和重复,然后各自表达,观察不同基因对小鼠肢体发育的影响。结果显示,HOXD基因簇中不同基因或其上游调控因子的重复或缺失都可能影响手指关节的发育,从而造成指(趾)数目或形态的异常。Kmita认为其原因可能是因为,在HOXD基因簇的远端有一增强子,这一远端增强子对HOXD基因存在增强作用,但HOXD同源基因之间对这种增强作用存在竞争性抑制,使得远端增强子的增强作用具有极性效应,越靠近5′端增强子作用越明显,从5′端向3′端增强子作用逐渐减弱。此前Goodman也曾发现一SPD家系中出现一117kb的染色体片段缺失。该缺失的片段