生物质谱分析课件

生物分析技术第5讲生物质谱分析

2011年10月生物分析技术第5讲生物质谱分析1第一节概述第二节质谱仪第三节生物质谱的应用主要内容第一节概述主要内容2质谱分析法(MassSpectroscope,MS)是将化合物形成离子或碎片离子，按质荷比(m/z)的不同进行测定，从而进行成分分析和结构分析的一种方法。根据质谱分析法的结果（质谱图）所提供的信息可以进行有机物、无机物的定性和定量分析，生物大分子的结构分析，同位素的测定及固体表面的结构和组成分析。生物质谱就是用于生物分子分析的质谱技术。由于生物分子大多数以其高相对分子质量区别于分子质量在几十到几千的无机或有机小分子，因而，生物质谱要求测定上万甚至几十万的分子质量。第一节概述质谱分析法(MassSpectrosco3早期，质谱分析法仅限于小分子和中等分子的研究，因为要将质谱应用于生物大分子需要将其制备成气相带电分子，然后在真空中物理分解成离子。如何使蛋白分子经受住离子化过程而又不丧失其结构形态是个难题。20世纪70年代，解吸技术的出现成功地将蛋白分子转化成气相离子，而后快原子轰击与其紧密相关的溶液基质使得具有极性、热不稳定的蛋白分子可经受住电离过程。但这些方法仅限于10kD以下蛋白分子的研究。80年代电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MAILDI)技术的发展则使得质谱方法成功应用于高分子量蛋白分子的研究。早期，质谱分析法仅限于小分子和中等分子的研41906年J.JThomson在实验中发现带电荷离子在电磁场中的运动轨迹与它的质荷比有关并于1912年制造出第一台质谱仪1946年飞行时间质量分析器1953年四极杆质量分析器1959年质谱仪首次用于多肽测序1965年离子共振质谱

1968年电喷雾离子源1974年傅里叶变换离子回旋共振分析器1987年基质辅助激光解吸电离质谱质谱仪的发展历史1906年J.JThomson在实验中5日本科学家田中耕一(KoichiTanaka)1959年出生于日本富山县首府富山市，1983年获日本东北大学学士学位，现任职于京都市岛津制作所，为该公司研发工程师，分析测量事业部生命科学商务中心、生命科学研究所主任。他对化学的贡献类似于约翰·芬恩，因此也得到了1／4的奖金。美国科学家约翰·芬恩1917年出生于美国纽约市，1940年获耶鲁大学化学博士学位，1967年到1987年间任该大学教授，1987年起被聘为该大学名誉教授，自1994年起任弗吉尼亚联邦大学教授。他因为“发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法”和“发明了对生物大分子的质谱分析法”而获得今年诺贝尔化学奖1／4的奖金。瑞士科学家库尔特·维特里希1938年生于瑞士阿尔贝格，1964年获瑞士巴塞尔大学无机化学博士学位，从1980年起担任瑞士苏黎世联邦高等理工学校的分子生物物理学教授，还任美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究所客座教授。他因“发明了利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法”而获得2002年诺贝尔化学奖一半的奖金。2002年诺贝尔化学奖获得者日本科学家田中耕一(KoichiTanaka)1959年出6第二节质谱仪一、质谱仪的工作原理二、质谱仪的基本结构1.真空系统2.进样系统3.离子源4.质量分析器5.检测与记录第二节质谱仪一、质谱仪的工作原理7离子源质量过滤/分析器样品板LC或GCEI源FAB源MALDI源ESI源QuadruopoleIontrapTime-of-flight电子倍增器闪烁计数器+++++++++++++++++++++++++++++++++++++一、质谱仪的工作原理样品导入系统检测器离子源质量过滤/分析器样品板EI源Quadruopole电子8

zU=(1/2)m

2m/z=2U/

2化合物分子在高真空条件下，受高速电子流“轰击”或强电场其他作用，失去电子生成离子或发生化学键断裂成为碎片离子，离子经加速器进入磁场，其动能与加速电压及电荷遵循：具有速度的带电离子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比的不同实现分离。zU=(1/2)m2化合物分子在高真空条9质谱仪的分类质谱仪的分类10二、质谱仪的基本结构质谱仪的构造和功能计算机控制与数据处理1.真空系统2.进样系统3.离子源4.质量分析器5.检测与记录二、质谱仪的基本结构质谱仪的构造和功能计算机控制与数据处理111质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，一般应在10-5～10-6Pa。

(1)真空度差，过多的氧气将损耗或烧毁离子源的灯丝；

(2)高本低气压将干扰质谱图;

(3)电离空气压过高，会发生离子-分子反应，改变碎片谱图；(4)离子源内的高气压将干扰电子束的调节；(5)电离气或离子源内的高气压，可能引起高达数千伏的离子加速电压放电。1.真空系统质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，一12一般质谱仪由机械真空泵(低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，使离子源和分析器部分的达到真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。一般质谱仪由机械真空泵(低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵132.进样系统要求：高效重复的将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低，而样品导入离子源的方式决定于样品的物理性质。方式：

(1)间歇式进样系统

(2)直接探针进样

(3)毛细管进样（从HPLC、GC及CE）

2.进样系统要求：14(1)间歇式进样系统可用于气体、液体和中等蒸汽压的固体样品进样，通过可拆卸式的试样管将少量固体或液体试样引入试样储存器中。由于进样系统的低压强及储存器的加热装置，使试样保持气态。加之进样系统的压强比离子源的压强大，样品分子或离子可以通过分子漏隙以分子流的形式渗透进高真空的离子源。(1)间歇式进样系统可用于气体、液体和中等15(2)直接探针进样通常将试样放入小杯中，通过真空闭锁装置将其引入离子源，可以对样品杯进行冷却或加热处理。(2)直接探针进样通常将试样放入小杯中，通16对于在间歇式进样系统的条件下无法变成气体的固体、热敏性固体及非挥发性液体试样，可直接引入到离子源。这种进样方式不必使样品充满整个储存器，因此，可适用样品量较小和蒸汽压较低的物质。直接进样法扩大了质谱法的应用范围。对于在间歇式进样系统的条件下无法变成气体的17(3)毛细管进样气相色谱-质谱联用仪

从毛细管气相色谱柱流出的成分可直接引入质谱仪的离子化室。(3)毛细管进样气相色谱-质谱联用仪18液相色谱-质谱联用仪

采用离子喷雾及电喷雾技术除去流动相使样品离子进入质谱分析仪。液相色谱-质谱联用仪19质谱仪中产生离子的装置称为离子源，其功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。不同的分子离子化所需要的能量不同，因此，应选择不同的离解方式：硬电离：能给予样品较大能量的电离方法。软电离：给予较小能量的电离方法，适用于易破裂或易电离的样品。3.离子源质谱仪中产生离子的装置称为离子源，其功能是将进样系统20(1)电子轰击电离源(ElectronImpactIonization,简称EI):样品需经过汽化进入电离区，用约70eV能量的电子束与气化的试样分子相互作用，使分子中电离电位较低的价电子或非键电子电离，为硬电离方法。1980年以前的主要离子化方式，只能用于有机小分子

(400Da以下)的电离。

质谱技术中的离子源(1)电子轰击电离源(ElectronImpactIo21电子轰击电离的优缺点优点灵敏度高；有达10万个化合物的数据库可快速检索；可根据碎片方式鉴定未知物；从碎片离子判定结构。缺点质量范围小；有可能汽化前发生解离；碎片过多有时看不到分子离子。电子轰击电离的优缺点优点22质谱技术中的离子源(2)化学电离源(ChemicalIonization,简称CI):高能电子束与小分子反应气（如甲烷、丙烷等）作用，使其电离生成初级离子，这些初级离子在与试样分子反应得到试样离子，核心是质子转移。(3)场电离(FieldIonization,简称FI):在相距很近的电极间施加高电压，产生强电场，依靠这个强电场将附近的试样分子中的电子拉出来，使之形成离子。质谱技术中的离子源(2)化学电离源(ChemicalIo23质谱技术中的离子源(4)快原子轰击源(FastAtomBombardment，简称FAB):20世纪80年代发展起来的新离子化方法，是让稀有气体（氙气或氩气）电离，通过电场加速，获得较高动能成为快原子，然后轰击试样分子，通过能量的转移，使试样分子电离。质谱技术中的离子源(4)快原子轰击源(FastAtom24快原子轰击技术优点：分子离子和准分子离子峰强；碎片离子峰丰富；灵敏度高，适用于热不稳定、极性强的分子，如肽类、蛋白质、多糖、金属有机物等。快原子轰击技术缺点：试样涂在金属板上，溶剂也被电离，使质谱图复杂化。快原子轰击技术优点：快原子轰击技术缺点：25质谱技术中的离子源(5)大气压化学电离源(AtmosphericPressureChemicalIonization，简称APCI):主要用于液相色谱-质谱联用仪，主要用来分析中等极性、弱极性化合物。APCI主要产生单电荷离子，分析化合物的相对分子质量一般小于1000.质谱技术中的离子源(5)大气压化学电离源(Atmosphe26APCI主要部件是一个双层套管组成的电喷雾的喷嘴，喷嘴内层是液相色谱流出物，外层是雾化气，通常为大流量的N2，其作用是使喷出的液体分散成微滴。在喷嘴的下游有一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+,N2+,O2+等离子，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。APCI主要部件是一个双层套管组成的电喷雾27(6)电喷雾电离(ElectrosprayIonization，简称ESI):是一种使用强静电场的电离技术。它主要应用于液相色谱-质谱联用仪或毛细管电泳-质谱联用仪，既作为色谱和质谱之间的接口装置，同时又是电离装置。质谱技术中的离子源(6)电喷雾电离(ElectrosprayIonizat28电喷雾电离是在“离子蒸发”的原理基础上发展起来的一种离子化方法。待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口，在喷口高电压作用下形成带电荷的微滴，随着微滴中的挥发性溶剂蒸发，微滴表面的电荷体密度随微滴半径的减少而增加，到达某一临界点时，样品将以离子方式从液滴表面蒸发，进入气相，即实现了样品的离子化，由于没有直接的外界能量作用于分子，因此，对分子结构破坏较少，是一种典型的软电离方式。电喷雾电离是在“离子蒸发”的原理基础上发展29电喷雾电离最大特点是容易形成多电荷离子，因此，在较小的m/z范围内可以检测到大分子质量的分子。电喷雾质谱目前可测定分子质量在100.000Da以下的蛋白质，最高达150.000Da。适宜相对分子质量大、稳定性差的化合物，如极性强的大分子有机化合物，蛋白质、肽、糖等。除分析大分子外，电喷雾质谱也可分析小分子，对于分子量在1000Da以下的小分子，也可得到物质的分子质量。电喷雾电离最大特点是容易形成多电荷离子，因30影响电喷雾电离的因素：样品的pKa和溶液的pH样品离子取决于样品在喷雾溶液中是否形成离子，正离子检测中，溶液pH应较低，负离子检测，溶液pH应较高。溶剂的性质用于电喷雾电离的溶剂应能使样品在溶液中形成离子，既有较低的溶剂化能力以利于离子蒸发，具有较低的黏度和表面张力以利于雾化以及具有较低热容量以利于溶剂化。影响电喷雾电离的因素：31电喷雾电离优缺点优点测定分子质量高；灵敏度极高（10-15mol）；软电离，可观察生物分子非共价反应；易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液；没有基质干扰；适于四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析；带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子，通过计算平均值给出更精确的质量数；特别适于测多肽的修饰；样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。电喷雾电离优缺点优点32电喷雾电离优缺点缺点耐盐能力低；对某些化合物特别敏感，污染难清洗；样品需先气化；带多电荷，在分析混合物时，产生混乱；定量时需内校准。电喷雾电离优缺点缺点33电喷雾与大气压化学电离的比较电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子。样品流速：APCI源可从0.2到2ml／min；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1ml／min.断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解.适用性：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子电喷雾与大气压化学电离的比较电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而34(7)基质辅助激光解吸离子化(MatrixAssistedLaserDesorption，简称MALDI):是近20年发展起来的离子化技术，特别适用于蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物大分子的离子化。通常用飞行时间检测器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱。可用于生物大分子物质分子量的测定；蛋白质高通量鉴定；有机小分子化合物分子量测定；寡核苷酸的分析；基因的单核苷酸多态性的分析等。质谱技术中的离子源(7)基质辅助激光解吸离子化(MatrixAssiste35基质辅助激光解吸电离工作原理基质辅助激光解吸离子化引入了固体基质，使样品液与基质液混合，滴于靶面，在真空中快速干燥，制成极细的混晶。当激光束照射在涂有样品和基质混晶的靶面上时，基质的有机分子在固态混晶中共振吸收能量，并将能量传递到基质有机物晶体的晶格中，使晶格受到瞬时强烈扰动而解吸出离子或中性分子，并通过这些离子或分子将吸收的能量传递给生物大分子而使其电离。基质辅助激光解吸离子化原理基质辅助激光解吸电离工作原理基质辅助激光解吸36基质辅助激光解吸离子化特点

①基质辅助激光解吸离子化中，激光的能量大量消耗于晶格扰动中，并不是直接作用与生物大分子使之裂解，因此是一种非常温和的离子化方式；

②激光采用N2激光源，波长为337nm，为脉冲式工作方式；

③基质辅助激光解吸电离源与飞行时间质量分析仪所构成的质谱仪，得到的质谱信息主要是分子离子、准分子离子，而碎片离子和多电荷离子较少。基质辅助激光解吸离子化特点①基质辅助激光解37基质辅助激光解吸电离源的关键是使用基质来实现软电离，基质的具体作用：从激光束吸收激光能量并转变为凝聚相的激发能；基质包围样品分子，使之相互隔离，限制聚集体的形成，避免聚集体大分子对解吸和分析的影响；促进样品分子的离子化过程。基质辅助激光解吸电离源的关键是使用基质来实现38基质辅助激光解吸电离源的基质种类很多，对于不同的分析对象应选择不同的基质，否则对分析结果影响很大。基质必须满足一些共性：在合适溶剂中具有良好的溶解性；对激光具有良好的吸收性能，以使能量在基质中积累；合适的反应活性。基质辅助激光解吸电离源的基质种类很多，对于不39常用基质基质缩写适用范围α-氰基-4-羟基肉桂酸HCCA生物高分子、糖蛋白、肽类、有机化合物、聚合物等3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸SA蛋白质、肽类、氨基酸2,5-二羟基苯甲酸DHB200～1000Da的有机化合物、氨基酸、肽类及糖蛋白3-羟基吡啶甲酸HPA约10000Da的聚合物、肽类、寡核苷酸、糖蛋白、糖肽及水溶性聚合物2,4,6-三羟基苯乙酮THAP蛋白质、肽类、氨基酸2,6-二羟基苯乙酮DHAP糖蛋白、糖肽、磷酸化肽常用基质基质缩写适用范围α-氰基-4-羟基肉桂酸HCCA生物40基质辅助激光电离源的优缺点优点质量数可达300,000Da；10-15至10-18级灵敏度；软电离方式，无或极少碎片离子；耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）；适于分析复杂混合物。缺点分辨率低；1000Da以下基质峰干扰；激光解吸附离子化有可能使样品光降解；不能分析非共价键相互作用；定量时需要内校准；如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。基质辅助激光电离源的优缺点优点缺点414.质量分析器质谱仪的质量分析器位于离子源和检测器之间，依据不同的方式将样品离子按质荷比分开。离子通过分析器后，按不同质荷比(m/z)分开，将相同的m/z离子聚焦在一起。质量分析器的类型：(1)磁分析器(2)四极杆分析器(3)离子阱(4)飞行时间分析器(5)傅立叶变换离子回旋共振分析器4.质量分析器质谱仪的质量分析器位于离子源42(1)磁分析器磁分析器依据不同质量的离子在磁场中有不同的运动行为，从而将离子分开。主要有两种形式单聚焦分析器和双聚焦分析器。(1)磁分析器磁分析器依据不同质量的离子在磁43单聚焦分析器只有一个磁场，当磁场强度和加速电场的电压不变时，离子运动的轨道半径仅仅取决于离子本身的质荷比(m／z)。因此，具有不同质荷比的离子，由于运动半径的不同而被分析器分开。缺点是分辨率较低，设计良好的单聚焦分析器的分辨率可达5000。它只适、化学电离源。合于离子能量分散较小的离子源，如电子轰击源单聚焦分析器单聚焦分析器只有一个磁场，当磁场强度和加速电场的电44双聚焦分析器在单聚焦分析器中，离子源产生的离子在进入加速电场之前，其初始能量并不为零，且各不相同。若具有相同的质荷比的离子，其初始能量存在差异，在通过分析器后，是不能完全聚焦在一起。为了解决离子能量分散的问题，提高分辨率，可采用双聚焦分析器。所谓双聚焦，是指同时实现方向聚焦和能量聚焦。双聚焦分析器除了磁场外，还有一个静电场，具有质量色散和能量色散，能够实现方向聚焦。双聚焦分析器在单聚焦分析器中，离子源产生的离45(2)四极分析器由四根截面为双曲面或圆形的棒状电极组成，两组电极间施加一定的直流电压和频率为射频范围的交流电压。(2)四极分析器由四根截面为双曲面或圆形的棒46四极质量分析器的工作原理与扇形磁场是不同的。扇形磁场靠离子动量的差别而把不同质荷比的离子分开，而四极质量分析器则是靠质荷比不同把离子分开。四极质量分析器又称四极滤质器。当离子束进入筒形电极所包围的空间后，离子作横向摆动，在一定的直流电压、交流电压和频率，以及一定的尺寸等条件下，只有某一种（或某一范围）质荷比的离子能够到达收集器并发出信号（称共振离子），其它离子在运动的过程中撞击在筒形电极上而被“过滤”掉，最后被真空泵抽走（称为非共振离子）。四极质量分析器的工作原理与扇形磁场是不同的。47因此，四极场只允许一种具有适当稳定振幅质荷比的离子通过。四个电极上的交流和直流电压从零到一最大值同步增加，可使不同质荷比的离子依次分离，按顺序通过四极场实现质量扫描。其扫描范围可由交流和直流的电压来调节。如果使交流电压的频率不变而连续地改变直流和交流电压的大小（但要保持它们的比例不变，电压扫描），或保持电压不变而连续地改变交流电压的频率（频率扫描），就可使不同质荷比的离子依次到达收集器而得到质谱图。因此，四极场只允许一种具有适当稳定振幅质48优点：①分辨率较高；②分析速度极快，满质量范围扫描一般只需几毫秒；③制作工艺简单，仪器紧凑，最适合与气相色谱和高效液相色谱仪联用。缺点：①质量测量上限为2000～4000Da；②准确度和精密度低于磁偏转型质量分析器。四极质量分析器的优缺点优点：四极质量分析器的优缺点49离子阱分析器近几年开始作为一种简易的质谱仪而出现的，一般与毛细管气相色谱仪联用。它的离子源与质量分析器同处一室。由色谱仪流出的组分直接送入兼作离子源和分析器的阱内。(3)离子阱离子阱的特点是结构小巧，质量轻，灵敏度高，而且还有多级质谱功能，它可以用于GC-MS，也可以用于LC-MS。离子阱分析器近几年开始作为一种简易的质谱仪50离子阱的主体是一个环电极和上下两个端盖电极，环电极和上下两端盖电极都是绕z轴旋转的双曲面，直流电压U和射频电压V加在环电极和端盖电极之间。

离子阱的主体是一个环电极和上下两个端盖电极，51离子阱构造离子阱构造52飞行时间质量分析器（timeofflightanalyzer）的主要部分是一个离子漂移管。样品受到阴极灯丝发出的电子轰击后变成离子，栅极G1上的负脉冲将离子引出离子室，G1，G2间的直流电压差使离子受到加速并进入无场漂移管，最终按m／z值不同先后到达离子接收极。(4)飞行时间分析器1-电离室；2-电子接收极；3-阴极；4-离子接收极飞行时间质量分析器（timeoffl53根据离子运动动能与电场势能的关系式：可以推导为：离子以速度ν进入漂移区，假定离子在漂移区飞行的时间为T，漂移区长度为L，则可得：根据离子运动动能与电场势能的关系式：可以推导为：离54因此，离子在漂移管中飞行的时间与离子质量的平方根成正比。对于能量相同的离子，离子的质量越大，达到接收器所用的时间越长，质量越小，所用时间越短。根据这一原理，可以把不同质量的离子分开。飞行时间质量分析器的特点是质量范围宽，扫描速度快，既不需要电场，也不需要磁场。但是，存在分辨率低这一缺点。因此，离子在漂移管中飞行的时间与离子质量的55造成分辨率低的主要原因在于离子进入漂移管前的时间分散、空间分散和能量分散。这样，即使是质量相同的离子，由于产生时间的先后不同，产生空间位置不同和初始动能的不同，达到检测器的时间就不相同，因而降低了分辨率。目前，采用离子延迟引出技术和离子反射技术，可以在很大程度上克服上述3个原因造成的分辨率下降。造成分辨率低的主要原因在于离子进入漂移管前的56通过离子反射技术，质量相同能量不同的离子进入反射器后，能量大的离子速度快，但走的距离远，能量小的离子速度慢，但走的距离近，经过反射后，二者同时到达检测器，这样就消除了由于能量分散造成的分辨率降低。1-离子源；2-检测器；3-反射器通过离子反射技术，质量相同能量不同的离子进入57离子不是直线飞行，而是在中途被反射后再到达检测器。这种方法有两点好处:①系统具有“双聚焦”功能，相同质量不同能量的离子被反射后能同时到达检测器；②离子的飞行路程增加了一倍。两者均有助于提高仪器的分辨率。飞行时间质谱仪的分辨率可达20000以上，最高可检质量超过300000Da，并且具有很高的灵敏度。离子不是直线飞行，而是在中途被反射后再到达检58生物质谱分析课件59(5)傅立叶变换离子回旋共振分析器傅里叶变换离子回旋共振分析器（Fouriertransformioncyclotronresonanceanalyzer，FTICR）是在原来回旋共振分析器的基础上发展起来的。假定质荷比为m/z的离子进入磁感应强度为B的磁场中，由于受磁场力的作用，离子做圆周运动（半径R），如果没有能量的损失和增加，圆周运动的离心力和磁场力相平衡，可得到：为离子运动的回旋频率（单位为弧度/秒）(5)傅立叶变换离子回旋共振分析器傅里叶变换离子60可以看出，离子的回旋频率与离子的质荷比成线性关系，当磁场强度固定后，只需精确测得离子的共振频率，就能准确地得到离子的质量。测定离子共振频率的办法是外加一个射频辐射，如果外加射频频率等于离子共振频率，离子就会吸收外加辐射能量而改变圆周运动的轨道，作螺旋加速运动，离子收集器放在适当的位置就能收到共振离子。改变辐射频率，就可以接收到不同的离子。可以看出，离子的回旋频率与离子的质荷比成线性61普通的回旋共振分析器扫描速度很慢，灵敏度低，分辨率也很差。傅里叶变换离子回旋共振分析器采用了线性调频脉冲来激发离子，即在很短的时间内进行快速频率扫描，使很宽范围分布的质荷比离子几乎同时受到激发，因而扫描速度和灵敏度比普通回旋共振分析器高得多。

普通的回旋共振分析器扫描速度很慢，灵敏度低，62傅里叶变换离子回旋共振分析器示意图质量分析室是一个立方体结构，由3对相互垂直的平行板电极组成，置于高真空和由超导磁体产生的强磁场中。第一对电极为捕集极，它与磁场方向垂直，电极上加有适当正电压，其目的是延长离子在室内的滞留时间；第二对电极为发射极，用于发射射频脉冲；第三对电极为接收极，用来接收离子产生的信号。傅里叶变换离子回旋共振分析器示意图质量分63样品离子引入分析室后，在强磁场作用下被迫以很小的轨道半径做回旋运动，由于离子都是以随机的方式运动，因此不产生可检出的信号。如果在发射极上施加一个很快的扫频电压，当射频频率和某离子的回旋频率一致时，共振条件得到满足。离子吸收射频能量，轨道半径逐渐增大，变成螺旋运动，经过一段时间的相互作用和能量传递，所有离子都做共振运动，产生可被检出的信号。样品离子引入分析室后，在强磁场作用下被迫以64共振运动的正离子运动至靠近接收极的一个极板时，吸收此极板表面的电子，当其继续运动到另一极板时，又会吸引另一极板表面的电子。这样便会感生出所谓的“相电流”。相电流是一种正弦形式的时间域信号，正弦波的频率和离子的固有回旋频率相同，其振幅则与分析室中该质量的离子数目成正比。共振运动的正离子运动至靠近接收极的一个极板时65如果分析室中各种质量的离子都满足共振条件，那么，实际测得的信号是同一时间内做共振轨道运动的各种离子所对应的正弦波信号的叠加。将测得的时间域信号重复累加，放大并经模数转换后输入计算机进行快速傅里叶变换，便可检出各种频率成分，然后利用频率和质量的已知关系，便可得到常见的质谱图。

如果分析室中各种质量的离子都满足共振条件，那66FT-MS有很多明显的优点：①分辨率极高，商品仪器的分辨可超过106。②分析灵敏度高，且在高灵敏度下可以得到高分辨率。③具有多级质谱功能。④可以和任何离子源相连，拓展了仪器功能。⑤扫描速度快，性能稳定可靠，质量范围宽。当然，FT-MS由于需要很高的超导磁场，因而需要液氦，仪器售价和运行费用都比较贵。FT-MS有很多明显的优点：67几种质量分析器优缺点对比优点缺点磁分析器价廉分子离子分辨率低。四极杆质量精度高，分辨率好碰撞能量低，碎片不完全离子阱相对价廉，质量精度高，分辨率好，适合多级质谱低能量碰撞TOF质量精度高，分辨率好，ESI、MALDI均可接需高真空，价高FTMS质量精度最高，分子离子分辨率好，非常适合多级质谱低能量碰撞，需超导磁体，价高几种质量分析器优缺点对比优点缺点磁分析器价廉分子离子分辨率低685.检测与记录电子倍增器是现代质谱仪广泛使用的检测装置。一般具有10～20个电极（铍铜合金或其他材料）。检测5.检测与记录电子倍增器是现代质谱仪广泛使用的检测69从质量分析器射出的具有一定能量的离子，打在第一极上并产生较多的二次电子，这些电子打在第三极上又产生数量更多的三次电子，在每一极上都重复这一过程。这样经过多极使电子不断倍增，最后被检测。电子倍增器响应快，灵敏度高。随着使用时间的延长，电极会老化，增益会降低，具有一定的寿命。从质量分析器射出的具有一定能量的离子，打在第70信号增益与倍增器电压有关，提高倍增器电压可以提高灵敏度，但同时会降低倍增器的寿命，因此，应该在保证仪器灵敏度的情况下，采用尽量低的倍增器电压。由倍增器出来的电信号被送入计算机储存，这些信号经计算机处理后可以得到色谱图、质谱图及其他各种信息。质谱仪常用的检测器还有闪烁检测器、法拉第杯和照相底板等。

信号增益与倍增器电压有关，提高倍增器电压可71光电转换倍增器（闪烁计数器）电子发射撞击荧光屏，荧光屏发射光子由光子放大器检测。光子放大器密封在容器中，光子可穿过密封玻璃，避免表面污染，寿命为5年。光电转换倍增器（闪烁计数器）电子发射撞击荧72记录现代质谱仪一般都配有高性能计算机，应用功能强大的操作软件，设置仪器工作参数，采集和处理数据，打印出报告。记录现代质谱仪一般都配有高性能计算机，应用功73第三节生物质谱的应用生物质谱主要用于解决两个生物大分子的分析问题：其一是精确测定生物大分子，如蛋白质、核苷酸和糖类等的分子量，并提供它们的分子结构信息；其二是对存在于生命复杂体系中的相互作用。生物质谱的应用主要包括：一、生物质谱在蛋白质和多肽研究中的应用二、生物质谱在多糖结构测定中的应用三、生物质谱在核酸分析中的应用第三节生物质谱的应用生物质谱主要用于解决74一、生物质谱在蛋白质和多肽研究中的应用1.相对分子质量测定2.肽谱测定3.肽序列测定4.蛋白质翻译后修饰5.蛋白质组分定量分析6.蛋白质相互作用研究一、生物质谱在蛋白质和多肽研究中的应用1.相对分子质量测定75相对分子质量是蛋白质、多肽、核酸、寡糖与多糖的最基本的物理参数之一，是蛋白质、多肽识别与鉴定中首先要测定的参数，也是基因工程产品申报新药的重要数据之一。相对分子质量正确与否代表着所测定的蛋白质结构正确与否，或者意味着一种新的蛋白质的发现。生物质谱可测定分子质量高达400kDa的生物大分子，准确度高达0.001%～0.1%，远远高于目前常规应用的SDS电泳或高效凝胶色谱技术。1.相对分子质量测定相对分子质量是蛋白质、多肽、核酸、寡糖与多糖762.肽谱测定肽谱：是蛋白质经过化学裂解或酶解后所获得的多肽混合物的图谱。肽谱分析结合蛋白质的氨基酸分析、序列分析所得到综合信息是鉴定蛋白质一级结构的重要技术手段。通过质谱获得的肽谱又称为肽质量指纹图谱，它是将蛋白质经酶解后得到的肽混合物进行质谱分析，给出全部肽段的准确质量，结合蛋白质数据库检索，可实现对蛋白质的快速鉴别和高通量筛选，也成为目前蛋白质组学研究中必不可少的重要技术手段。2.肽谱测定肽谱：是蛋白质经过化学裂解或酶解77肽谱鉴定流程样品酶解酶解片断一级质谱PMF肽指纹图谱串联质谱对库检索序列数据库成功鉴定PSMs及后筛选序列分析未知蛋白肽谱鉴定流程样品酶解酶解片断一级质谱PMF串联质谱对库序列数78胰蛋白酶酶解采用含乙腈的脱色液脱色至胶块变为白色真空干燥仪中冷冻干燥胰蛋白酶酶解过夜采用含TFA和乙腈的溶液溶进行肽提取真空干燥采用含TFA和乙腈的溶液溶解样品并点样进行质谱测试胰蛋白酶酶解采用含乙腈的脱色液脱色至胶块变为白色79质谱分析MALDI-TOF/TOF4800质谱仪先用MS反射模式得到一级图谱一级质谱激光扫描次数:800次选择5-10个母离子做MS/MS分析二级MS/MS激光扫描次数:2000次，碰撞能量1KV质谱分析MALDI-TOF/TOF4800质谱仪80数据库检索采用GPSExplore(V3.6，ABI)软件进行分析使用MASCOT（V2.1,MatrixScience,London,U.K）搜库软件对本地数据库进行检索检索数据库为NCBInr，切割的酶为trypsin，允许最大的未被酶切位点数为1,可变修饰为半胱氨酸乙酰胺化和甲硫氨酸氧化，没有固定修饰，母离子质量容差为50ppm，片段离子质量容差为0.25Da数据库检索采用GPSExplore(V3.6，ABI)81肽指纹图谱鉴定PMF（PeptideMassFingerprinting）是根据一级质谱（MS）所测酶解片段的精确分子质量鉴定蛋白质的一种方法一般采用MALDI-TOF进行鉴定。因为MALDI质谱图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的信息与实际测得的质量信息进行对比而实现鉴定肽指纹图谱鉴定PMF（PeptideMassFinger82优点与缺点优点：一级质谱鉴定蛋白质的经典方法，算法简单，速度快缺点：质量相近的多肽增加匹配难度无法实现混合蛋白的鉴定优点与缺点优点：83二级质谱鉴定质谱仪选择一级质谱中的一个峰，让这些峰所代表的离子高速撞击质谱仪中的惰性气体，使其肽键断裂，并对库搜索鉴定蛋白质常用MALDI-TOF／TOF仪器进行二级质谱鉴定质谱仪选择一级质谱中的一个峰，让这些峰所代表的离84优点与缺点优点：鉴定准确度更高，可以得到蛋白的序列可以实现多个蛋白的鉴定缺点：增加了一步操作算法更复杂，而且需要更多的操作经验优点与缺点优点：85串联质谱结果——质谱图从一级质谱图里选出部分峰做二级质谱一级质谱图二级质谱图串联质谱结果——质谱图从一级质谱图里选出部分峰做二级质谱一级863.肽序列测定技术肽序列测定技术C端酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，灵敏度低。质谱法：灵敏度高，准确性好，易操作，具有普适性。N端化学降解法：用探针试剂氨基酸苯异硫氰酸酯与游离氨基作用，再用各种层析技术分离；测序速度慢，样品用量大、纯度要求高。3.肽序列测定技术肽序列测定技术C端酶解法：利用氨肽酶和羧肽87串联质谱技术可直接用于肽序列测定，通过采用不同的质谱技术选择具有特定质荷比的离子，并对其进行碰撞诱导解离，通过推断肽片的断裂，可将肽序列导出。通常在低能气相碰撞的条件下，肽离子碎片沿着骨架在酞胺键处断裂，产生一个序列离子阶梯。通过减掉相邻序列离子的质量，由一种或两种离子系列可推测出氨基酸的序列。串联质谱技术可直接用于肽序列测定，通过采用不同884.蛋白质翻译后修饰大多数生物所表达的蛋白质需经过一系列的翻译后加工和修饰才能形成最终复杂的功能执行体，所以蛋白质的翻译后修饰成为蛋白质组学研究的重要方面。蛋白质的修饰类型主要有磷酸化、糖基化等。蛋白质磷酸化的分析最令人关注，因为蛋白质的磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的所有过程。4.蛋白质翻译后修饰大多数生物所表达的蛋白质89蛋白质糖基化修饰的研究最近也有报道，主要是利用蛋白质组结合生物质谱技术，通过核素标记研究N-糖基化蛋白质。蛋白质修饰的研究一般采用二维电泳-免疫印迹-质谱技术，即用亲和技术提取修饰肽段，并用串联质谱鉴定修饰肽段来研究蛋白质磷酸化或糖基化。蛋白质糖基化修饰的研究最近也有报道，主要是90质谱确定蛋白质的磷酸化位点的方法：①用磷酸酯酶处理和MALDI-TOF-MS-PMF相结合找出混合肽段中哪一个肽段被磷酸化了;②采用三级四级杆串联质谱的前体离子扫描技术进行检测;③用傅立叶变换离子回旋质谱的电子捕获解离技术鉴定肽片段的磷酸化位点。质谱确定蛋白质的磷酸化位点的方法：①用磷酸酯酶处理和MALD915.蛋白质组分定量分析为了在质谱分析中实现对蛋白质的准确定量，1999年引入了核素编码亲和标签(ICTA)技术。ICTA是一种人工合成的化学试剂，其结构包括专一的化学反应基团（与蛋白质的半胱氨酸反应）、核素标记的连接子和亲核反应基团。分别用不同的ICTA标记不同的蛋白，再进行等量混合、胰酶消化、亲合层析和在线LC-MS/MS分析，就能找到表达差异的蛋白，并用MS/MS鉴定出是何种蛋白。最近又发展了新一代的标记试剂，在连接子和亲和反应基团之间增加了一个酶解位点，这样使裂解后核素标签的分子量减小。5.蛋白质组分定量分析为了在质谱分析中实926.蛋白质相互作用研究大部分蛋白质的功能执行是通过蛋白质-蛋白质相互作用来实现的，因此，蛋白质相互作用成为蛋白质组学研究的重要组成部分。质谱技术对蛋白质相互作用的研究主要有两种策略：①首先通过生化的方法纯化蛋白质复合体，然后用质谱鉴定其组分。②将混合蛋白质直接酶解，用多维色谱串联质谱进行鉴定。6.蛋白质相互作用研究大部分蛋白质的功能执93二、生物质谱在多糖结构测定中的应用多糖是醛糖和(或)酮糖通过糖苷键连接在一起的天然聚合物，它可参与细胞的生命活动，具有多种生物学功能。然而并不是所有的多糖都具有活性，多糖的活性在很大程度上是由它的结构决定的，因此对于糖结构的研究，无论是对高活性糖的寻求和开发，还是对糖生物学中构效关系的探索与研究，都具有至关重要的意义。二、生物质谱在多糖结构测定中的应用多糖是醛94质谱技术于20世纪50年代末开始用于糖的分析，它可以提供相对分子质量、多糖的单糖组成、糖苷键的连接方式以及分支状况等多种信息，在糖类的分析中发挥着不可替代的作用。近年来，各种软电离技术相继诞生,使质谱技术在糖生物学的研究中取得了很大的进展。主要包括以下应用：1.相对分子质量测定2.寡糖结构分析3.寡糖序列分析质谱技术于20世纪50年代末开始用于糖的分析，它可以提供相对951.相对分子质量测定化学电离质谱传递的能量较少而容易得到准分子离子峰。在多糖分析中常用的反应气有异丁烷和氨气。如以NH3为反应气体就能给出[M+NH4]+作为基峰，从而很容易推导出相对分子质量。快原子轰击质谱，通过正离子方式增加一个质子或阳离子、也可通过负离子方式失去一个质子产生准分子离子作为谱图的主要信号，并给出反映连接顺序等信息的碎片。因此，可用来测定寡糖链的相对分子质量，同时还可以根据相对分子质量计算出寡糖的聚合度。1.相对分子质量测定化学电离质谱传递的能量较962.寡糖结构分析GC-MS可以提供有关寡糖残基类型、链的连接方式、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息。多糖为大分子物质，不能直接挥发,因而须将多糖降解为结构单糖或寡糖，并且将其衍生成具有易挥发,对热稳定的衍生物。在应用GC-MS进行多糖的结构分析时，通常