基于微流控技术的蛋白质结晶研究进展

基于微流控技术的蛋白质结晶研究进展

蛋白质是所有生命活动的基础。分析蛋白质的分子结构有助于理解其功能和分子作用的机制。这对于有关生命周期和疾病的诊断和治疗非常重要。1.x射线衍射技术是目前最重要、最可靠的蛋白质结构测定技术，也是当前结构生物学研究的主要平台技术。由于蛋白质在结晶过程中受到蛋白质纯度、添加剂、沉淀剂类型、离子强度、ph值和温度等因素的影响，结晶过程非常复杂。目前，纯理论无法成功预测蛋白质结晶的最佳条件。因此，如何获得足够的演绎分辨率的蛋白质晶体是贯穿结构的主要问题。2.4现在，大规模的结晶条件筛选仍然是获得高质量蛋白质晶体的主要手段。然而，传统的蛋白质结晶筛选技术样品含量高，研究成本高，难以广泛应用于低表达蛋白质的结构生物学研究。一些低发现的蛋白质通常在生命活动中发挥着极其重要的作用。生命科学研究的重要突破往往依赖于新技术的发展和新仪器的研发.为了降低蛋白质结晶筛选的样品消耗量,仪器制造商相继开展了高通量蛋白质结晶筛选系统的微型化研究,推出了一系列纳升级的结晶筛选机器人,其中具有代表性的有英国Douglas公司研制的Oryx-nano系列结晶机器人、美国ArtRobbins公司研制的Phoenix机器人及英国TTPLabTech公司研制的Mosquito系列机器人等［6～8］.采用这些筛选系统可使单个筛选反应的蛋白质消耗量降低到50~200nL,比常规筛选系统降低了20~100倍,同时也有效减少了研究成本和时间.然而,对于膜蛋白等一些难以表达纯化的珍稀蛋白质样品,此类仪器的蛋白质耗样量仍然过高,难以满足结构生物学研究的需要.进一步降低蛋白质结晶筛选耗样量的主要技术难点在于:(1)由于蛋白质和沉淀剂溶液具有高黏度和较低的界面张力,现有的超微量液体处理方法(喷墨打印和固体缝针接触点样)难以在皮升到纳升级范围内进行可靠的液体量取和转移;(2)随着液体体积的缩小,比表面积增加,蒸发效应显著增加(如在常规实验室条件下,一个数皮升的水滴会数秒内即可完全挥发);(3)微体系下液体的比表面积显著增加,生物分子在水/气界面和水/固界面上的分子自组装或非特异性吸附［9］易引起分子失活［10］、损失以及交叉污染,从而可能导致筛选结果的假阳性或者假阴性.微流控技术是现今国际高新科技前沿领域之一.它采用微机电技术加工出具有微米尺度通道网络结构的芯片,通过对芯片中皮升至纳升级微流体的操纵和控制,实现生物医学和化学实验室的集成化分析检测功能.在微流控技术发展的早期就出现了在芯片上进行蛋白质结晶的成功案例［11，12］.然而,由于早期的微流控芯片多采用硬质的半导体硅材料,在加工技术和流体驱动方法上均受到较大限制,因此相关研究进展缓慢［8］.近年来,采用基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜的微泵微阀技术、液滴(Droplet)技术、滑动芯片(SlipChip)以及液滴实验室(DropLab)技术的微流控系统在蛋白质结晶及其筛选研究中的应用取得了快速发展［13］.微流控技术已逐渐成为蛋白质结晶微型化研究最有潜力的发展方向之一.利用微流控技术进行蛋白质结晶的主要优势有:(1)微流控系统对超微量液体的操控能力可将蛋白质结晶的样品消耗量降低至几个纳升甚至是皮升级水平,从而使许多珍稀蛋白质的结构生物学研究成为可能;(2)微体系下一些特殊的物理和化学效应对蛋白质晶体的成核和生长具有良好的促进作用(如微体系下重力导致的溶液内部环流效应显著降低,蛋白质晶体的生长堆积较为整齐,可提高晶体结构鉴定的分辨率);(3)微流控技术具有通道网络大规模集成和溶液操纵自动化的特点,可大幅减少复杂繁琐的手动液体操作,缩短实验时间,从而有效提高筛选的通量［14］.国内外现有的关于微流控蛋白质结晶的综述文章分别着重介绍了PDMS薄膜微泵微阀［13，15～17］及液滴［13，16～19］等技术在蛋白质结晶方法上的相关应用,而对于微流控蛋白质结晶技术实现的细节方面介绍较少,对于非微流控研究领域的科研人员,不易理解其具体的原理和方法.本研究组在微流控芯片领域进行了较长时间的研究,利用微流控技术进行了蛋白质结晶条件筛选方面的研究,发展了基于连续流液滴［20］及液滴实验室(DropLab)［21］等相关技术的蛋白质结晶筛选方法.本文以我们近几年的研究工作为基础,从微流控技术角度出发,综述基于微流控技术的蛋白质结晶筛选方法,并对各类技术的优缺点及其应用进行了详细评述.1基于pdms的气动微阀微量流体的控制是微流控技术的核心操作,而蛋白质结晶筛选所涉及的液体量取、进样、混合及孵育等过程均需要多样化的流体控制技术.2000年,Quake等［22］首次采用多层软光刻技术制作了PDMS气动微阀,该阀以外部气体作为驱动力,结合弹性PDMS薄膜材料,实现了微流控通道内流体的可靠封闭和流体切换.在此基础上,Quake等［22］研制出由多个气动微阀构成的微型蠕动泵,实现了微通道内灵活的流体驱动.由于其可靠的流体操控性能,PDMS薄膜微泵微阀技术成为早期应用于微流控蛋白质结晶领域的主要技术.1.1基于pdms的蛋白质结晶PDMS微阀主要包含3层结构:上层是加工有气路控制通道的基片,中层为加工有流体通道的PDMS薄膜,下层为玻璃基底.气路控制通道和流体通道呈垂直角度放置.通过外置的气路三通阀控制气路通道内的压力来实现微阀的开启和闭合.施加气压时,中间层的PDMS薄膜发生形变,向下挤压流体通道,直至通道闭合.撤销压力时,PDMS薄膜在自身弹力的作用下恢复原状,流体通道恢复开启状态［22］[图1(A)].自由界面扩散(FID)是一种有效的蛋白质结晶方法.常规的FID方法是在毛细管两端分别加入蛋白质和沉淀剂溶液,在浓度梯度的驱动下,2种溶液在界面处发生自由扩散,使蛋白质溶液浓度达到过饱和而出现晶体.因此,FID方法的优点是单次实验即可以实现大量浓度条件的筛选,获得最佳的沉淀剂浓度.但常规的FID方法存在蛋白质溶液消耗量大、难以精确控制扩散速度以及由于重力导致的对流影响［23］等问题,从而限制了该方法的广泛使用.2002年,Quake等［24］首次将PDMS微阀技术应用于基于FID方法的蛋白质结晶筛选研究.在约4.8×104Pa的压力下,将蛋白质和沉淀剂溶液注入到封闭的PDMS芯片微管道中.由于PDMS具有一定的透气性,微管道和微腔室中的空气可在压力的作用下扩散进入PDMS中,从而使蛋白质和沉淀剂溶液填充到被微阀隔离的2个封闭腔室内.开启微阀可连通2个腔室并在微通道内形成2个溶液的界面,通过界面发生蛋白质和沉淀剂的自由扩散.由于微米级通道的微尺度效应,重力导致的流体对流可以忽略不计［25］.另外,通过设计平行化的通道结构和不同的微腔室尺寸,单块芯片可以同时筛选48种不同沉淀剂,每种沉淀剂以3种不同比例混合[图1(B)],从而实现144次结晶条件的筛选实验,以获得适合蛋白质结晶的沉淀剂条件[图1(C)].该方法的总试剂消耗量不到3μL,与常规方法相比蛋白质消耗量显著降低.Quake等［26］进一步利用PDMS薄膜透水蒸汽的特点,研制了一种集成纳升级FID结晶、动态浓度优化及原位X射线晶体解析的多功能微流控芯片.在原FID芯片的基础上,该芯片增加了位于微腔室上方的储液池,微腔室与储液池之间采用厚度为250μm的PDMS薄膜隔离.当蛋白质和沉淀剂溶液在界面处发生自由扩散时,微腔室和储液池中的溶液在渗透压的作用下同时进行水蒸汽扩散,实现了蛋白质结晶过程的动态优化,从而得到较大尺寸的高质量蛋白质晶体.另外,将含有蛋白质晶体的芯片选择性切割下来,进行原位的X射线衍射分析,从而减少了繁琐的晶体衍射实验步骤,并避免了晶体收集过程中可能对晶体造成的伤害.1.2实验模型的建立PDMS微泵通常由3个平行排列的微阀组成,通过程序化循环控制3个微阀的开启和闭合来实现通道中流体的驱动[图2(A)].由于其液流驱动方式与蠕动泵类似,因此也称蠕动微泵［22］.PDMS微泵具有操控简单、体积小、集成度高及低流量控制精确等优点,是微流控技术的典型代表.基于PDMS薄膜微泵和微阀技术,Quake等［27］研制了一种可在纳升级水平系统研究蛋白质相行为的配比芯片(Formulatorchip).该配比芯片主要由2个结构单元组成,分别用于纳升级液体的精确量取和快速混合[图2(B)].纳升级液体量取单元由1个蠕动微泵(Pump1)、3个微阀以及1个试剂储存通道组成;快速混合单元由1个圆形定量环、2个蠕动微泵(Pump2和Pump3)以及多个微阀组成.实验中,首先打开控制阀使圆形定量环整体充满缓冲液,关闭定量环的微阀;在试剂储存通道中充满沉淀剂溶液,再打开试剂储存通道与定量环之间的微阀;启动液体量取单元中的微泵Pump1,注入定量体积的沉淀剂溶液进入圆形定量环中,并排除多余的缓冲液;关闭定量环的微阀,启动混合结构单元中的蠕动泵Pump3注入定量体积的蛋白质样品溶液,在定量环中形成具有一定配比的蛋白质/沉淀剂/缓冲液区带;最后启动定量环上的蠕动泵Pump2,使定量环中的蛋白质和沉淀剂快速混合.采用明场成像对混合过程中的溶液状态进行实时监控,并根据定量环区域像素灰度值的标准偏差,得到蛋白质在当前沉淀剂条件下的溶解状态.利用PDMS微泵准确的液体定量能力,可快速得到不同沉淀剂/蛋白质溶液的配比条件,获得蛋白质的相行为.他们利用该配比芯片测试了32种不同沉淀剂条件下蛋白质木聚糖酶的相行为,每种沉淀剂平均以134种不同比例混合,共进行了4300个配比条件下溶解行为的测定,总耗时仅为20h,总蛋白质消耗量约8μL.系统地研究蛋白质在不同沉淀剂条件下的相行为可用于指导未知结构蛋白质结晶条件的筛选,提高筛选的成功率.Quake等［28］还利用该配比芯片系统地研究了12种不同蛋白质(其中8种蛋白质尚未成功得到晶体结构)的相行为,成功得到9种蛋白质的结晶条件,其中3种蛋白质晶体获得了高分辨率的衍射分析结果.2微流控液滴技术区别于连续的流体,液滴是指一相液体被与其不互溶的另一相或者多相液体隔离形成的非连续流体.传统的液滴通常是将水相和油相通过高速机械搅拌或者微孔膜挤压,在表面活性剂(乳化剂)作用下形成的大量乳液状液滴,也称为乳液.由于水相液滴被油相分离和包裹,每个液滴均可视为独立的微反应器,因此液滴在上个世纪60年代即被用作高通量的超微量反应器进行单分子酶活性的研究.然而,采用机械搅拌方法形成的液滴大小不均一且体积难以精确控制,限制了此技术的应用.2001年,Quake等［29］首次采用微流控芯片T型通道形成单分散的油包水液滴,显著提高液滴的均一性和可控性,提出了一种新的微液滴生成思路,并得到快速的发展［30］.微流控液滴系统具有高通量生成、低交叉污染［31，32］、快速混合［33］及有效的表面控制［34］等优势,已广泛应用于蛋白质结晶［35，36］、反应动力学测定［33，37，38］、基因分析［32］及化学合成［39］等领域.采用微流控液滴技术进行蛋白质结晶及筛选具有许多优点:(1)液滴反应器的体积由微升级降低到纳升级,有效降低了试样消耗,特别适用于珍稀蛋白质样品的结晶研究;(2)液滴生成通量较高,通过流速控制可快速生成大量不同蛋白质和沉淀剂配比条件的液滴反应器,以进行蛋白质结晶条件的筛选和优化;(3)微流控液滴芯片结构简单、加工难度小、无需复杂的外置泵阀系统且设备相对简单,因此研究成本较低;(4)通过在水相中加入不同种类的表面活性剂,可以灵活调节液滴反应器的界面性质,从而促进蛋白质的成核过程.目前,用于蛋白质结晶研究的微流控液滴技术主要可分为连续流液滴技术、液滴装载器技术、基于PDMS微泵微阀的液滴技术以及液滴实验室(DropLab)技术.2.1带液滴的蛋白质结晶Ismagilov等［36］首次利用T型通道芯片连续生成液滴,进行蛋白质结晶条件的筛选和优化研究.该芯片主要包含一个油相流入通道,一个水相流入通道以及一个液滴流出通道.其中水相流入通道包含3个分支通道,分别为蛋白质溶液通道、缓冲液通道以及沉淀剂通道.水相液流和油相液流在T型通道的交叉口交汇形成油水界面,在油相剪切力及界面张力的作用下,水相液流被分割成分散的油包水液滴.通过调节水相分支通道中各溶液的相对流速,可快速地改变液滴反应器中蛋白质和沉淀剂的相对浓度[图3(A)].因此,连续流液滴系统特别适用于筛选和优化适合结晶的蛋白质和沉淀剂浓度.Garsteckil等［40］研制了一种基于连续流液滴技术的蛋白质相行为测定芯片.该芯片在蛋白质、沉淀剂和缓冲液3条通道中分别集成了一个电磁阀和T型通道用于液滴生成.通过改变电磁阀的开闭时间,可以精确控制蛋白质、沉淀剂和缓冲液的液滴尺寸.液滴在通道交汇处发生融合,从而形成具有不同蛋白质、沉淀剂及缓冲液配比的液滴反应器,可利用原位散射方法测定反应器内蛋白质的不同状态.由于连续流液滴系统常用的PDMS芯片具有一定的透气性,液滴反应器在长时间孵育过程中存在水相蒸发的问题.针对该问题,Ismagilov等［35，41］发展了一种PDMS-玻璃毛细管复合芯片的方法来进行液滴反应器的生成和长时间孵育,该复合芯片由PDMS芯片和玻璃毛细管两部分组成.液滴在PDMS芯片T型通道内生成［36］,并在油相的驱动下顺序进入毛细管中.当毛细管中充满液滴后,将毛细管与PDMS芯片分离,再用蜡密封毛细管两端,液滴即可在毛细管中进行长时间孵育.由于液滴的蒸发基本被抑制,这种蛋白质结晶模式称为微批量法(Microbatch).他们还利用具有双T型通道的复合芯片交替生成配对的蛋白质结晶液滴和高浓度盐溶液液滴,并以能透水蒸汽的油相间隔,收集于毛细管中进行孵育反应.由于高浓度盐溶液和蛋白质结晶溶液之间存在渗透压差,蛋白质结晶液滴逐渐失水,液滴中蛋白质溶液缓慢达到过饱和,进而得到蛋白质晶体[图3(B)].这种蛋白质结晶方法一般称为蒸汽扩散(Vapordiffusion)结晶法.该研究组利用上述复合芯片,通过改变水相和油相的流速来调整相邻液滴之间的距离,从而达到动态调控结晶液滴失水速率的目的.以溶菌酶为模型蛋白,经过24h的孵化,蛋白质液滴的结晶率大于50%,单个结晶液滴体积仅为25nL.此外,玻璃毛细管具有较好的光学性质,可直接对液滴内的蛋白质晶体进行原位X射线衍射分析,避免了繁琐的晶体收集过程.连续流液滴系统具有液滴生成通量高,试样消耗低的优点,特别适用于特定沉淀剂条件下的快速浓度优化.然而,在蛋白质结晶条件的筛选实验中,常常需要进行大量不同种类沉淀剂的筛选,这在常规的连续流系统中难以实现.我们［20］发展了一种样品切换系统,可快速将不同沉淀剂引入至液滴系统中,从而实现不同沉淀剂的筛选.该系统由一个具有集成化取样探针的液滴芯片及一个自动化缺口管阵列换样系统组成,其中取样探针内集成了沉淀剂引入通道、蛋白质/沉淀剂汇合通道、油相通道以及液滴形成通道.实验中,水平移动缺口管阵列,使取样探针浸入缺口管内沉淀剂溶液中,在负压的驱动下,沉淀剂溶液进入引入通道中与蛋白质溶液汇合,在液滴形成通道内形成液滴阵列[图3(C)].该系统每小时最高可生成6×103个液滴.筛选一个沉淀剂条件的蛋白质耗样量为2.4nL,在保证快速筛选不同沉淀剂的同时,显著降低了蛋白的消耗量.2.2维沉淀剂液滴阵列的形成为了实现不同沉淀剂的筛选,Ismagilov等［18，19，42］还发展了一种液滴装载器技术.采用该技术进行蛋白质结晶条件筛选主要分成2个步骤:(1)分别将毛细管插入不同沉淀剂溶液中,依次吸取不同的沉淀剂溶液和间隔油相形成一维沉淀剂液滴阵列;(2)将沉淀剂液滴阵列毛细管与微流控芯片上的T型通道连接,在正压的驱动下,将蛋白质溶液顺序注入到每个沉淀剂液滴中形成结晶反应器,并收集到毛细管中进行孵育反应.为了防止不同沉淀剂液滴之间由于黏度或者表面张力差异而相互融合,他们在相邻沉淀剂液滴之间引入一个气泡,将两相流变为三相流,有效提高了液滴操控的稳定性［42，43］.将液滴装载器技术用于索马甜蛋白结晶条件的筛选,共测试了商品化试剂盒中的48种沉淀剂,单个液滴体积为15nL,总蛋白质溶液消耗量小于1μL.2.3基层微流控制剂.3.Hansen等［44］在配比芯片［27］的基础上发展了一种结合PDMS芯片微泵微阀技术和液滴技术的集成化、大规模蛋白质结晶条件筛选系统.该系统结合了微泵微阀技术的液体操控灵活和液滴技术的反应封闭的优点.首先利用微泵微阀系统进行自动化、程序化的蛋白质与沉淀剂溶液的定量量取和快速混合;然后将混合后的反应液注入液滴形成区域,在油相的包裹下形成液滴,进行长时间的孵育反应.生成的液滴反应器存储于16条平行阵列通道中,可在10mm×7mm的芯片区域存储400个体积为2nL的液滴反应器,便于进行高通量的晶体成像检测.与传统液滴系统不同,该系统通过微泵和微阀对液滴产生的频率、间距及体积进行精确控制,避免了液体黏度、界面张力及流速等参数对液滴生成的影响,有效提高了液滴的可控性.他们利用该系统测定了过氧化氢酶在不同分子量的聚乙二醇沉淀剂条件下的相行为,生成了该蛋白质的三维相图,实现了蛋白质结晶条件的全面筛选,并可直接成像得到每个条件下的结晶筛选结果,从而有利于选择出蛋白质结晶的最佳条件.Fraden等［45］发展了一种可实时控制和观察蛋白质溶液相行为的微流控芯片,称之为“相芯片”(Phasechip).该“相芯片”由上下两层PDMS芯片封合而成,其中上层PDMS芯片用于液滴的生成和存储,下层PDMS芯片通入盐溶液来调节渗透压,两层之间采用PDMS薄膜进行隔离.实验中,首先通过微阀来控制液滴的流向和流速,使之进入指定的存储通道,使液滴在表面张力的作用下自动进入存储通道两侧的存储凹槽,达到液滴存储和寻址的目的;然后在结晶孵化的前42h向下层PDMS通道中连续注入高浓度的NaCl溶液,产生的渗透压使结晶液滴慢慢失水,蛋白质溶液达到过饱和,出现大量微晶,此时的溶液浓度条件位于成核区;最后将下层PDMS通道中的NaCl溶液换成低浓度的NaCl溶液,使结晶液滴吸水,蛋白质和沉淀剂的浓度逐渐降低,部分微晶重新溶解,溶液浓度条件进入结晶生长区,从而孵化出较大尺寸的蛋白质单晶.通过这种实时观察和动态调节的方式,可精确控制蛋白质结晶中的成核过程与晶体生长过程,从而提高晶体的质量.2.4拉尖毛细管注射系统采用微流控芯片T型通道或者十字通道夹流的方法生成液滴反应器时,液滴的尺寸、间距及频率等参数容易受到流速、流体黏度、界面张力和通道表面性质等因素影响,并且难以灵活改变液滴的组成和大小.针对现有液滴系统的一些局限性,我们［21］发展了一种基于液滴组装技术的蛋白质结晶筛选平台———液滴实验室(DropLab).该系统主要由3个部分组成:一根拉尖的毛细管用于液体的取样、组装以及储存;一台与毛细管连接的高精度注射泵用于液体的定量量取;一套基于缺口管阵列或者安装在三维平移台上的384孔板的试样储存装置.整套装置的操作均由计算机进行自动化控制.实验中,转动缺口管阵列或者移动384孔板,使毛细管尖依次插入蛋白质样品管、沉淀剂样品管以及油相储存管中,在注射泵驱动下依次吸入一定体积的沉淀剂和蛋白质溶液,并在毛细管中组装形成蛋白质结晶液滴反应器[图4(A)和(B)].DropLab系统能够精确控制液滴的组成,并且液体定量量取、液滴组装、样品切换及试样混合等操作均在计算机控制下完成,有效提高了微流控蛋白质结晶条件筛选的自动化程度,避免了繁琐耗时的手工操作和人为差错.将DropLab系统应用于溶菌酶的结晶条件筛选,每个液滴消耗蛋白质样品6nL,一共筛选了50个沉淀剂条件,蛋白质总耗样量为300nL[图4(C)].利用该系统还可对筛选得到的沉淀剂条件进行蛋白质/沉淀剂浓度配比的优化,获得最优化的蛋白质结晶条件.3基于用户装卸方法的滑动芯片系统微型化和操作简便化一直是微流控蛋白质结晶技术发展的主要趋势.微泵微阀技术和液滴技术在减少试剂消耗和提高筛选通量方面取得了显著的进步,但是这两类技术均需外加液压来控制操作,需要气源、切换阀及注射泵等配件,仪器设备较为复杂和昂贵.Ismagilov等［46～48］发展了一种无需外围设备的滑动芯片技术,并成功用于多模式的蛋白质结晶和筛选研究中.最初的滑动芯片主要由具有微结构的上下两块玻璃基片组成,下层基片的微孔用于储存预装载的待筛选沉淀剂液滴,上层基片的通道用于引入蛋白质样品溶液.实验中通过上下基片相互滑动的方法,使上层基片中的蛋白质溶液分别与下层基片中的沉淀剂液滴混合形成结晶反应器,整个操作在油相中完成［46］[图5(A)].将该滑动芯片用于细菌光合作用反应中心蛋白的结晶条件筛选[图5(B)],共筛选了24种沉淀剂,总蛋白消耗量为1μL.该方法操作简单,无需泵阀驱动,但沉淀剂预装载的操作方法复杂且费时.Ismagilov等［47，48］进一步发展了一种基于用户装载方法的滑动芯片.在该芯片上层基片上加工了蛋白质样品引入通道和沉淀剂液滴储存微孔,在下层基片上加工了沉淀剂引入通道和蛋白质样品储存微孔.实验中,首先将上下基片的沉淀剂引入通道与沉淀剂储存微孔对准,注入不同的沉淀剂溶液,滑动芯片形成分离的沉淀剂液滴;然后再将上下基片中的样品引入通道与样品储存通道对准,注入蛋白质样品溶液,滑动芯片使蛋白质样品与沉淀剂液滴混合,形成结晶反应器.同时,由于结晶反应器中的蛋白质和沉淀剂的相对体积由上下层基片的微孔尺寸决定,因此可通过芯片设计进行蛋白质/沉淀剂配比的结晶条件优化.该芯片可以同时进行48种沉淀剂的筛选,每种沉淀剂条件可与蛋白质样品进行11种不同比例的混合反应,每个筛选条件蛋白质消耗量约12nL,528个筛选反应的蛋白质总消耗量约为10μL.基于用户装载的操作方法,他们［48］还研制了结合微批量结晶和自由界面扩散结晶的多模式、多参数蛋白质结晶条件筛选复合滑动芯片.该滑动芯片具有用于微批量结晶和自由界面扩散结晶的通道结构.与微批量结晶通道结构相比,自由界面扩散通道结构增加了多条宽度为104~58μm,长度为91~491μm的微通道.在第二次滑动芯片时,含有蛋白质和沉淀剂的微孔通过这些微通道进行连接.蛋白质和沉淀剂溶液在微通道内发生扩散,进行自由界面扩散结晶.该复合芯片上加工有16个相对独立的流体单元,可进行16种不同沉淀剂的筛选,每个单元具有5个微批量结晶反应器和6个自由界面扩散结晶反应器,因此单块芯片可进行176种不同条件的筛选实验,蛋白质总消耗量仅为4μL.采用该芯片筛选得到了结核杆菌水合酶和牛焦虫二氢叶酸还原酶/胸苷酸合成酶的结晶条件.实验结果表明,采用这种复合滑动芯片进行多模式蛋白质结晶条件筛选,可获得比单一结晶模式下更多的结晶条件.4基于自动进样的磁流变控制板除了上述的PDMS芯片微泵微阀、液滴、滑动芯片和DropLab技术之外,研究人员还发展了其它微流控技术用于微量蛋白质的结晶与筛选研究.如Sauter等［49，50］根据常规逆向扩散(Counter-diffusion)结晶法研制了类似的逆向扩散蛋白质结晶芯片.他们在芯片上加工出“树型”的微通道,从“树根”端加入蛋白质样品,从“树枝”端加入不同的沉淀剂.通过蛋白质和沉淀剂分子的相互扩散,在微通道中形成了从溶解区、亚稳区、成核区到沉淀区的一系列浓度梯度［51］,进而获得产生结晶的最佳浓度.利用该树型结构芯片可同时实现对8种不同沉淀剂的逆向扩散筛选,并能实现常温X射线原位分析,蛋白质总消耗量为2~3μL.Li等［52］研制了一种基于离心力驱动的磁盘型微流控芯片.首先将蛋白质和沉淀剂溶液分别加到对应的入口中,在毛细作用下,蛋白质和沉淀剂自发进入各自的通道中,并在通道和反应腔的连接处停止.当旋转芯片时,通道中的蛋白质和沉淀剂溶液会在离心力的作用下进入到反应腔中并发生混合,形成结晶反应器.单块芯片可实现24种不同沉淀剂的筛选,每个反应器的体积为31nL,蛋白质的总消耗量为360nL.罗娅慧等［53］利用PDMS材料的透气性［54］,研制了一种具有自动进样功能且集成多个渗透脱水通道的蛋白质结晶筛选芯片.该芯片由样品通道层、透析膜、脱水通道层以及玻璃基片4层结构组成.预先将芯片进行真空脱气处理,利用其在大气压下重新吸收空气的能力在封闭的微管道中产生负压,使样品溶液自动进入到样品通道层的微通道中.样品通道层和脱水通道层之间由只能通过水分子和其它有机小分子的PDMS薄膜隔开.通过在脱水通道中充入不同浓度的盐溶液实现对蛋白质溶液脱水速度的控制,可同时实现96个蛋白质结晶条件的筛选.5膜蛋白结构解析膜蛋白是细胞膜功能的主要执行者之一,是细胞中一类重要的蛋白质分子,主要承担着物质运输、能量转换和信号转导等重要功能.膜蛋白与许多疾病的作用机理密切相关,目前50%以上药物的作用靶标是膜蛋白［55，56］,因此膜蛋白的结构解析对于膜蛋白的功能研究和药物研发均具有重要意义.自1985年Deisenhofer等［57］得到了第一个膜蛋白结构之后,研究人员相继解析出一系列重要膜蛋白的晶体结构.然而,蛋白质结构数据库中收录的已解析膜蛋白结构数仅占全部蛋白质的0.7%左右,大量重要的膜蛋白结构仍未得到解析.目前,膜蛋白的结构解析仍是生命科学领域中极具挑战性的难题之一.与水溶性蛋白相比,膜蛋白难以表达,不易获得足够的蛋白质用于结晶条件的筛选［58］;并且膜蛋白分子具有较强的疏水性,需要从一系列昂贵的去垢剂中筛选出最适合膜蛋白纯化和结晶的去垢剂［58～60］.因此,由于膜蛋白结晶的复杂性,开展新型膜蛋白结晶筛选技术的研究显得尤为重要.近年来,利用微流控芯片已实现了多种膜蛋白样品的结晶,为高通量、低消耗的膜蛋白结晶筛选提供了一种新思路.现有的微流控膜蛋白结晶技术主要可分为基于去垢剂和基于脂质立方相的结晶技术.5.1x-射线衍射分析基于去垢剂的微流控膜蛋白结晶系统采用去垢剂辅助膜蛋白溶解进行结晶研究和筛选,该系统所采用的微流控技术与水溶性蛋白结晶系统类似,主要有PDMS芯片微泵微阀技术、液滴技术以及滑动芯片.Quake等［28］采用配比芯片与FID芯片联用的方法筛选出了野生盐杆菌菌视紫红质、盐杆菌菌视紫红质突变体和类球红细菌细胞色素3种膜蛋白的结晶条件.通过结晶体积放大的方法得到了高质量的蛋白质晶体,并对3种膜蛋白晶体进行了X射线衍射分析,衍射分辨率在0.67~1.6nm之间.Ismagilov等［61］发展了一种结合连续流液滴和液滴装载器的蛋白质结晶芯片,可同时进行大量不同沉淀剂的筛选和浓度优化.该芯片被用于荚膜红细菌光合作用反应中心蛋白和荚膜红细菌膜孔蛋白两种膜蛋白的结晶.该研究组发展的滑动芯片［46～48］也被用于膜蛋白芽绿菌光合作用反应中心蛋白的结晶条件筛选.5.2膜蛋白结晶模式基于去垢剂的蛋白质结晶方法对膜蛋白结构生物学的研究起到了极大的推动作用,但去垢剂分子会影响膜蛋白的稳定性和晶格的有序堆积,可能导致难以结晶或者得不到足够衍射分辨率的高质量晶体.Caffrey等［62］发展了一种基于脂质立方相(LCP)的膜蛋白结晶方法.由于膜蛋白在LCP中的构象与在细胞膜中十分相似,将纯化后的膜蛋白从去垢剂复合物中置换到LCP中进行结晶,可以保持膜蛋白的天然结构,获得高质量的晶体.目前,研究人员已发展了一些基于LCP的微流控膜蛋白结晶技术,主要包括PDMS芯片微泵微阀技术和液滴技术.传统的LCP结晶法需要先将脂质与蛋白质水溶液混合,形成凝胶状的LCP,然后将LCP点样至沉淀剂溶液中,进行结晶孵育.该步骤繁琐、操作难度大,需要大量的膜蛋白溶液进行操作.基于微泵微阀技术,Kenis等［63］研制了一种自动化进行LCP生成