实验六 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量(预习报告)

生物化学实验预习报告实验六SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量一、研究背景电泳技术的发明是人们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上一次伟大的飞跃，在实际应用的过程中，人们发现了它在大量样品纯化上的劣势以及分析上的突出优点，进行“扬长避短”，最终将其作为生物大分子分离鉴定的常用技术而被保留与发展下来。自电泳技术发明以来，生命科学领域迅猛发展，人们对生物大分子的研究不能仅仅停留在分离、纯化、鉴定这些宏观操作上，需要确定它们的分子量进行更加深入的研究，所以迫切需要一种新技术能够测定像蛋白质这样的生物大分子的相对分子质量。人们又把目光转移到迅猛发展的电泳技术上来，试着去寻找突破口。在之前的非变性电泳技术中，生物大分子得以分离的基础是基于三方面的差异，即分子质量、分子大小与形状、电荷性质。如果要测定种生物大分子的分子质量，直接测定难度很大，这就需要首先找到一个参照标准（标准蛋白），在待测蛋白与标准蛋白之间进行“差异缩小”，将他们在电场中泳动速度的大小仅仅体现为分子量上的差异，再通过寻求某种线性关系就能得到蛋白质样品的分子质量。此外，人为地借助其他物质处理来缩小这些差异也就意味着破坏蛋白质的原有结构，变性电泳便成了必然。这一步是整个技术的核心，也是最难的突破的。1967年，Shapiro年首次报告了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，根据他对11种蛋白质电泳获得的结果，发现蛋白质（或亚基）分子量的对数与蛋白质分子的迁移率之间有直线关系。随后，Weber等人进行深入研究，肯定了Shapiro的发现，确立了以连续的磷酸盐系统作为电极缓冲系统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的新方法。后来，Laemmli将SDS电泳和Davis的不连续盘状电泳结合起来，设计出了不连续的SDS-Tris-甘氨酸系统。[1]由于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好、微量、设备简单、价廉和操作容易、迅速等优点，因而得到了迅速的发展和广泛的应用，目前已成为蛋白质研究的有力工具，广泛地应用于分子生物学、生物化学、遗传学、病理学、微生物学和植物生理学等学科的研究中。在本次实验中，我们采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tris-甘氨酸系统）测定蛋白质分子量，体会学习这一技术的发明历程、原理及操作。二、研究目标1.体会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的发明历程；2.进一步学习和掌握垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与方法；3.学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。三、研究策略1.同时对蛋白质样品和标准蛋白进行处理，消除他们在形状以及电荷量上的差异，仅剩下分子量的差异；2.将处理后的样品和标准蛋白在相同条件下进行电泳，他们的迁移速度不同，经过一段时间后，会体现出迁移距离上的差异。3.分析相对迁移率和蛋白质分子质量之间的关系，作出图像，计算样品蛋白的相对迁移率，从图像上直接得出它的分子质量。四、研究方案及可行性分析1.研究方案SDS（十二烷基硫酸钠，sodiumdodecylsulfate）是一种很强的阴离子表面活性剂，它以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的SDS-蛋白质复合物。SDS和蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为1.4:1，由于这种高密度的结合，新引入的净电荷远远超过蛋白质分子原有的净电荷，从而消除或极大地降低了不同蛋白质分子之间原有净电荷的差异，即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。SDS-蛋白质复合物具有均一的电荷密度、相同的荷质比。据流体力学等方面的研究推测，SDS-蛋白质复合物呈紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴是恒定的，在18A的数量级，与蛋白质的种类无关；棒的长轴是变化的，而且与蛋白质的分子量成正比。这就是说，SDS和蛋白质结合后所形成的SDS-蛋白质复合物，消除了由于天然蛋白质分子形状的不同对电泳迁移率的影响。带电分子电泳迁移率的大小取决于三个方面，即带电荷的多少、分子量的大小和分子的形状。根据上面的分析，SDS作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS和蛋白质结合后使其电泳迁移率仅取决于蛋白质分子量的大小，因而可以通过比较未知分子量的蛋白质和已知分子量的蛋白质分子的迁移率，测定出未知蛋白质的分子量。2.可行性分析从基本的实验原理、到研究方案和具体操作，再考虑实验器材和时间等因素，本实验均有较大的可行性。在具体操作中需要注意以下问题：（1）SDS处理样品之后保证蛋白质的迁移率仅取决于分子量大小。操作时，首先应保证SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，才能消除电荷的差异。还要注意加入还原剂如巯基乙醇，充分断开二硫键，在SDS和还原剂共同作用下，使蛋白质解聚成多肽链，随后与SDS充分结合，消除结构（形状）差异。（2）电泳操作中一系列条件的控制。此处不再赘述。五、具体实验设计1.实验仪器及试剂仪器：垂直板电泳槽及附件、直流稳压电源（600V，100mA）、10mL注射器1支；微量进样器（100μl×1）；器具：微量可调手动移液器；试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、十二烷基硫酸钠（SDS）、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵、甘油、巯基乙醇、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、盐酸、乙酸、冰醋酸；材料：实验四麦清蛋白脱盐样品。

2.实验步骤[2]（1）电泳槽的安装（10min）洗液浸泡玻璃板→热水、馏水冲洗→干燥，装入硅胶夹套，垂直固定于两半槽之间（对角线螺旋依次拧紧）→高玻板一侧注入2%的琼脂（防漏胶）（2）制胶（30min）A.按照下表所示配制分离胶（T%=12.5%）名称分离胶缓冲液Acr/Bis储备液dH2OTEMED过硫酸铵用量（ml）2.74.53.70.0050.2小烧杯中混匀立即灌胶（电泳槽微倾）→灌至距短玻璃片顶端2cm→放平电泳槽，立即用滴管覆盖水层→界面二次出现时，静置将水倒出（余下的水用滤纸片吸干）B.按照下表配制浓缩胶名称浓缩胶缓冲液Acr/Bis储备液dH2OTEMED过硫酸铵用量（ml）1.250.753.00.0050.020混合均匀后立即灌胶，同分离胶灌至方法，灌至与矮玻板顶端相齐时，立即插入梳子。C.向电泳槽内倒入电极缓冲液，短玻璃片一侧没过顶端，长玻璃片没过电极丝。小心拔梳子准备点样（3）样品的处理（15min）Marker：市售标准样品按要求处理；待测样品：麦清蛋白初步提取的凝胶过滤脱盐实验所获峰值管制备的SDS样品。将上述样品均置于沸水浴中加热5min，冷却上样（上样量：Marker20μl；待测样品梯度上样，4μl、10μl、20μl、30μl、50μl）。（4）电泳（2.5h）取稳流状态，浓缩胶15mA，分离胶20mA（注意电压）。特别注意溴酚蓝前沿指示剂不能跑丢。（5）检测（2.5h）取胶板置于水中浸泡10min→胶板置于染色液中加热2h（通风橱）→脱色液脱色至条带清楚→观察结果。（6）测量蛋白质分子的迁移率和未知样品的分子量将溴酚蓝迁移距离定为d1，蛋白质迁移距离定为d2，根据下面公式计算各种蛋白质的迁移率Rm：Rm=d以标准蛋白迁移率为横坐标，对应的分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，得到一条直线。根据未知样品的迁移率