流式细胞仪检测小鼠IFN

预实验：流式细胞仪分别检测小鼠外周血IFN-Y和IL-4RPMI1640培养液佛波酯PMA、离子霉素lonomycin、莫能菌素Monensin配肝素钠配PBS固定/透化剂（棕色瓶）BDPerm/washTMBuffer（1x）PEanti-mouseIFN-y（0.2mg/ml）PE/Cy7anti-mouseIl-4（0.2mg/mL）FITCanti-mouseCD4（0.5mg/mL）流式管+EP管红细胞裂解液（1x）染色缓冲液1、 激活剂PMA（引起T细胞的活化）储存：1mgPMA+10mlDMSO配制成0.1mg/ml，分装20山/管，一20度。勿反复融冻。实验1：用无菌、无叠氮钠PBS1：100稀释储存液，终浓度为20ng/ml。实验2：无菌1640稀释成1:100的工作液，500ul全血+12.5ul工作液，终浓度为25ng/ml。2、 激活剂离子霉素Ionomycin（协同活化T细胞）储存1：1mg+2ml乙醇配制成0.5mg/ml的储存液，一20度。实验1：用无菌、无叠氮钠PBS1：10稀释储存液，终浓度为1ug/ml。储存2：1mg+2mlDMSO配制成0.5mg/ml的储存液，一20度。实验2：用无菌1640液1：10成工作液，500ul全血+10ul工作液，终浓度为1ug/ml。，3、 阻断剂莫能菌素（阻断细胞因子分泌至胞外）储存1：用DMSO配制成浓度为1mg/ml的储存液，4°C储存至少4个月实验1：用无菌、无叠氮钠PBS1：10稀释储存液，终浓度为2umol/L。储存2：50mg+1ml甲醇配成50mg/mlrrr实验2：无菌16401:500稀释成0.1mg/ml工作液，500ul全血+8.5ul工作液，终浓度1.4ug/ml。流式细胞仪检测小鼠外周血 CD4+Q红细胞裂解液使用前放置室温3） 取抗凝血100"加入到标记好的流式管内，加入以FITCRatAnti-MouseCD4（0.5mg/mL）4） 避光放置30min5） 加入红细胞裂解液mL，轻轻吹打混匀，室温避光反应5min，以1500河离心5min，弃上清。（看看破红效果如何，效果不好可重复）6） 加2mL尸85混匀后，1500rpm离心5质沥，弃上清。7） 细胞沉淀加入00皿郁5重悬后，流式细胞仪分析。流式细胞仪检测小鼠外周血IFN-Y、IL-4（三色）1） 眼球采血一只鼠，2mlEP管内血量约1ml,事先加入肝素钠溶液300ul（按照30ul肝素钠溶液：100ul全血的比例）2） 刺激培养• 【CD4】【IFN-g】【IL-4】【实验】【空白】Ep管加入100^1全血+100^1刺激RPMI1640培养液（含有佛波酯PMA40ng/ml、离子霉素lonomycin2umol/L及莫能菌素Monensin1.4ul/ml三种试剂）预实验PMA佛波酯（1mg/ml）0.05ul（0.5ulPMA+9.5ul培养基取0.5ul）Ionomycin离子霉素（0.5mg/ml）4ulMonensin莫能霉素1.4ulUpto1ml•【对照】100ul全血+100ul不含刺激物的1640培养液于37°C、5%CO2中孵育4h,计时器计时，手机计时每半小时轻轻颠倒混匀一次。3） 裂解红细胞将上述液体转移到流式管内（200J1L），加入》浓度的红细胞裂解液2mL（预实验中红细胞裂解液采用1ml+9ml稀释，准备一个离心管），轻轻吹打混匀，室温避光，15mins。以1500rpm离心5min，弃上清，留沉淀。每管中加A2ml染色缓冲液混合均匀，1500rpm，5min离心，弃上清，留沉淀。4） 细胞表面抗原的染色（CD4）•【CD4】【实验】【对照】管各加FITCanti-mouseCD4（0.5mg/mL）_^ul+染色缓冲液98ul•【IFN-g】【IL-4】【空白】加入100pL染色缓冲液室温避光15min后，每管中加入2ml染色缓冲液混合均匀，1500rpm，5min离心，弃上清，留沉淀。5） 固定和透化细胞每管中加入500pl固定/透化剂（棕色瓶），充分混匀，避光20min，1500rpm离心5min，弃上清，留沉淀。加2ml1xBDPerm/washTMBuffer（预实验中用之前留下来的试剂），避光10min，1500rpm，离心5min，弃上清，留沉淀。6)胞内细胞因子的染色【CD4】【空白】加入100pLPerm/washTMBuffer【IFN-y】加入95pLPerm/washTMBuffer+5pLPEanti-mouseIFN-y(0.2mg/ml)【IL-4】加入95pLPerm/washTMBuffer+5pLPERatAnti-MouseIL-4(0.2mg/mL)【实验】【对照】5pLPEanti-mouseIFN-y(0.2mg/ml)+5pLPERatAnti-MouseIL-4(0.2mg/mL)