石墨烯的研究进展

石墨烯的研究进展

石墨烯是一个二维多环芳香烃原子晶体。它被称为英语石针剂（石墨）+-dea（烯类结构剂的终结），也被称为“单层石墨”。它被认为是科学研究和科学研究的新世界。2004年,英国曼彻斯特大学的A.K.Geim和K.S.Novoselo成功地在实验中从石墨中分离出石墨烯,并证实它可以单独存在。二人因此获得2010年诺贝尔物理学奖。石墨烯的碳原子排列与石墨的单原子层类似由碳原子以sp2杂化轨道呈蜂巢晶格(honeycombcrystallattice)排列构成。由于原子间作用力很强,其结构非常稳定。悬浮的石墨烯片层并不完全平整,它们表现出物质微观状态下固有的粗糙性,表面会出现几度的起伏。Meyer等认为这些表面皱褶是其存在的必要条件。也有人认为二维石墨烯是从三维石墨上剥离下来的,强大的原子间作用力保证了石墨烯即使在高温下也不会发生热力学膨胀。这种严格意义上的二维材料赋予石墨烯丰富和出众的理化性质。它是目前世上最薄却也是最坚硬的纳米材料。它几乎完全透明,只吸收2.3%的光;导热系数达5300W·(m·K)-1,高于碳纳米管和金刚石;常温下其电子迁移率超过15000cm2·(V·s)-1,高于碳纳米管或硅晶体;而电阻率约为1×10-6Ω·cm,比铜或银更低,有望用于制造透明触控屏幕、光板,甚至太阳能电池。可以说,石墨烯的研究推动了包括凝聚态物理、材料科学在内等一系列学科的发展。正是基于这些不同寻常的光电特性,研究人员也在不断发掘石墨烯在生物医学领域的应用,尤其是构建给药系统等方面。本文以此为切入点,在简要介绍石墨烯的分类和制备的基础上,重点讨论近年来其在生物医学领域的一些研究进展。1石墨烯的制备方法目前常见的石墨烯类材料包括石墨烯、氧化石墨烯(GO)和还原氧化石墨烯(r-GO)等,其制备方法丰富多样,现简要介绍如下。1.1化学气相沉积法目前获取石墨烯的经典方法是微机械分离,即直接从较大的晶体上将石墨薄层剥离下来。Geim等用这种方法制备出可在外界环境下稳定存在的单层石墨烯。获取石墨烯的另一种方法是用一种材料与膨胀或有缺陷的热解石墨摩擦,石墨块材的表面会产生含有单层石墨烯的絮片状晶体。这种方法的缺点是筛选出的单层石墨烯的尺寸不易控制,无法有效地制备规定长度的石墨烯样本。化学气相沉积法将含碳的烃类气体充入经过加热的具有反应活性的镍表面,高温加热后急速冷却至室温,再将沉积在镍表面的石墨浸入硝酸溶液,石墨烯会因为其疏水性从基底脱落下来。加热SiC法将6H-SiC高温加热后脱去Si,可在其(0001)面上分解产生石墨烯。这样所得的石墨片层很薄,层的厚度主要由加热温度决定,具有较强的可控性,可能成为今后工业化生产石墨烯的主要方法之一。此外还有多种制备方法,如金属表面生长法、氧化减薄石墨片法、肼还原石墨烯法、乙氧钠裂解法和切割碳纳米管法等。这些方法各有利弊,高质量、可控且低成本的石墨烯制备方法将成为研究热点。1.2石墨烯的制备石墨烯是一类憎水性物质,而GO拥有羟基、羧基、环氧官能团和羰基等大量的含氧基团,是一种亲水性物质(图1)。石墨烯的层间距由氧化前的0.335nm增加到0.710nm。可以高度分散在水溶液或其他有机溶剂中,利用还原去氧反应或简单加热处理能够将其转变成石墨烯。目前最常用石墨的氧化方法是Hummers法。该法将浓硫酸置于冰水浴内,加入石墨粉和无水硝酸钠,强力搅拌下再加入高锰酸钾和双氧水,过滤、洗涤、真空脱水得到官能团较丰富、水溶性良好的氧化石墨。该方法安全、简便且成本较低。通常用热膨胀法或超声分散方法使氧化石墨剥离成单层或层数较少氧化石墨片层,即GO。高度分散的GO还可以与包括聚合物在内的很多物质形成复合纳米材料,这种改性可以大大降低石墨烯类材料的潜在毒性,为其生物医学应用奠定基础。1.3r-go2石墨烯材料在生物医学领域的应用研究2.1其他特殊类型细胞的毒性根据前述,石墨烯及其衍生物在生物医学领域的应用潜力引起研究人员的极大兴趣。首先,一个非常重要的研究方向是系统了解石墨烯及其衍生物自身的毒性和生物相容性。Zhang等比较了石墨烯和单壁碳纳米管对嗜铬神经细胞瘤PC12细胞的影响,借此证明碳材料的形状与其诱导的细胞毒性直接相关。有趣的是,低浓度下石墨烯引起的代谢活动强于碳纳米管,而在较高浓度时情况恰好相反。相比石墨烯,单壁碳纳米管能显著诱导细胞内乳酸脱氢酶表达水平的升高。石墨烯与细胞作用产生的活性氧呈浓度和时间依赖性,符合氧化应激(oxidativestress)机制。10μg·mL-1石墨烯水溶液即可导致caspase3活化,预示着细胞的凋亡。这些研究表明石墨烯可诱导明显的细胞毒效应,且这些效应存在浓度和形状依赖性。此外,对石墨烯的适当功能化可能调控其细胞毒作用。Sasidharan等发现羧基功能化的亲水性石墨烯对细胞没有任何毒性,而未经处理的纯石墨烯则大量积累在细胞膜上,造成细胞强烈的氧化应激并导致凋亡(图2)。他们认为羧基功能化能削弱石墨烯和细胞间较强的疏水相互作用,抑制由此产生的毒性。针对GO的毒性研究也有一些报道。Hu等发现人的体细胞对GO比较敏感,其细胞毒性大小与GO的浓度呈依赖性。研究认为GO薄片与细胞膜之间的直接物理机械作用导致了细胞的凋亡;GO对蛋白质具有极强的吸附能力,将10%胎牛血清包覆GO后,其细胞毒性大大降低。最近,Chang等研究了GO对人肺癌A549细胞的形态、活力、死亡率和细胞膜完整性的影响,以此考察其毒性。结果表明,GO没有进入A549细胞,并没有明显的细胞毒作用。但GO可引起剂量依赖性的细胞氧化应激,在高浓度下亦可轻微损伤细胞活性。细胞的毒效应与材料的剂量和尺寸有关,因而在生物应用中必须充分考虑。不过,鉴于细胞可以在GO薄膜上良好生长,他们认为GO在细胞水平上还是一个相当安全的物质。Liao等探索具有可控物理和化学性质的石墨烯类材料的生物相容性,包括其对人类血细胞及表皮细胞的毒性。通过测量悬浮红细胞的血红蛋白流出,可用于评估材料的血液相容性。结果发现小尺寸的GO具有较强的溶血能力,而团聚的GO溶血能力较低。进一步以壳聚糖修饰GO后,溶血性则几乎完全消除。这些结果表明,石墨烯颗粒大小、颗粒状态、其表面的氧含量/电荷都能强烈影响红细胞的生物/毒理响应。他们还通过考察人类皮肤成纤维细胞的线粒体活性来评估石墨烯薄片和GO的细胞毒性。利用水溶性四唑盐WST-8、台盼蓝染色和活性氧检测等手段均证实密堆积的石墨烯薄片对成纤维细胞的损害高于堆积疏松的GO。总体看来,相关的毒性主要取决于暴露环境(即是否发生聚集)和细胞的作用模式(即悬浮与贴壁细胞类型)。从上述文献不难看出,在某些情况下石墨烯与GO均表现出一定的体外毒性。造成这种毒性的因素非常复杂,材料和细胞的具体状态都不能被忽略。但通过某些功能化(如羧酸化、高聚物修饰和蛋白温育)处理则可以大大改善这种细胞毒作用,这将有助于其在生物医学上的应用。2.2小鼠体内的药代动力学研究除了体外毒性研究,石墨烯在体内的毒性和代谢情况也被广泛关注,这关系到其是否能够应用于生物医学的诸多方面,其中发展针对各类石墨烯纳米功能材料的生物相容性高分子表面涂层至关重要。一般认为,聚乙二醇(PEG)功能化材料的免疫原性很低,非常适于体内研究。Liu课题组采用荧光标记方法,研究了近红外探针Cy7标记的聚乙二醇功能化石墨烯在几种移植瘤小鼠模型的体内行为。体内荧光成像显示这些模型对聚乙二醇化石墨烯的摄入量特别高。与聚乙二醇化碳纳米管不同的是,聚乙二醇化石墨烯显示了几个有意义的体内行为,包括高效的肿瘤被动靶向和在网状内皮系统(RES)内较少的潴留。此外,组织学、血液化学和完整的血液分析表明该石墨烯没有明显的副作用。进一步利用125I标记法研究了聚乙二醇化纳米石墨烯的体内生物分布和代谢动力学,并系统考察了石墨烯在雌性Balb/c小鼠体内的长期毒性。结果表明,静脉注射后聚乙二醇化石墨烯主要积累在网状内皮系统如肝和脾,并很可能经由肾脏和粪便排泄被逐步清除。血液生化、血液分析和组织学的切片染色检查结果均证实,在20mg·kg-1的剂量下,聚乙二醇化石墨烯在3个月内不会对小鼠产生明显毒性。最近对GO的体内代谢研究发现,将广泛用于表面涂层的生物相容聚合物材料葡聚糖(DEX)共价偶联GO表面,形成石墨烯-葡聚糖(GO-DEX)(图3)。这种结合使GO尺寸降低、厚度增加,并显著提高其在生理条件下的稳定性。DEX能明显降低细胞毒性。用125I标记复合物作为动物体内示踪研究。与聚乙二醇化石墨烯类似,静脉注射后GO-DEX也积聚在肝和脾等网状内皮系统。重要的是,小鼠体内的复合物在1周内被大量清除,而不会造成明显的短期毒性。相比之下,Fan课题组认为未作修饰的GO的毒性更应受到重视。与GO-DEX不同的是,GO主要沉积在肺部并能停留很长时间,而在网状内皮系统摄取量很低,可作为潜在的靶向肺部的药物输送载体。与其他碳纳米材料相比,GO在血液中有较长的循环时间[半衰期(5.3±1.2)h],对红细胞也表现出良好的生物相容性。1mg·kg-1剂量作用14天,小鼠的器官没有病变。但是,由于它的高积累性和潴留时间长,在10mg·kg-1剂量下可发生显著病变,包括炎症细胞浸润、肺水肿和肉芽肿形成。因此,为了发展基于石墨烯的新型生物医学应用,生物涂层将是不可或缺的,而且还需要进一步研究其长期的体内毒理学行为。2.3在生物医用领域的应用石墨烯层内C原子共同形成一个大的π键,能通过非共价π-π堆积和疏水相互作用吸附大量客体分子,尤其是单链DNA或RNA以及具有芳香环类的化合物,因而是这类分子中非常出色的药物载体。Dai课题组最早将石墨烯类材料用于药物递送研究。他们发现石墨烯通过简单吸附策略来携载各类药物分子,包括不溶的芳香类抗癌药物分子如喜树碱类似物SN38、表皮生长因子受体(EGFR)的有效抑制剂易瑞沙(iressa)等。SN38溶解性差,药效很低,而水溶性的PEG化石墨烯纳米复合物载体拥有独特的二维形状和超小尺寸(约5nm),可明显改善这种药物的溶解性,开拓了药物的实际应用。Yang等利用同样的非共价π-π堆积作用,将阿霉素高效加载到GO上形成GO-阿霉素纳米杂合物(nanohybrid)。在药物初始浓度为0.47mg·mL-1时,GO载药量高达2.35mg·mg-1。阿霉素的装载和释放呈较强的pH依赖性,可能与GO和阿霉素间的氢键作用有关。近期的工作仍在强调用功能高分子来提高石墨烯类材料的水溶性和生物相容性。如壳聚糖(CS)是优良的生物材料,可作为肿瘤给药载体。Bao等通过简单的酰胺化反应完成CS在GO上的共价接枝,制备了含约64%(质量比)CS的GO-CS复合物。GO-CS可通过π-π堆叠和疏水相互作用大量携载水溶性差的抗癌药物喜树碱。该载药复合物与HepG2肝癌细胞和HeLa细胞作用时的细胞毒性较单纯药物有明显提高。GO-CS还能与质粒DNA复合形成稳定的纳米复合物转染HeLa细胞,其转染效率较为理想。Rana等研究了布洛芬(ibuprofen)和氟尿嘧啶等药物在GO-CS上的控释行为。证明GO-CS载体能携载和递送抗癌药物和基因,是一种很有前途的生物医用新材料。同样,具有高度亲水性和生物相容性的聚乙烯醇(PVA)也被用于功能化GO,通过π-π相互作用在其表面装载喜树碱(CPT)等抗癌药物,用于人类乳腺癌和皮肤癌细胞的研究。以明胶作为还原剂和防止聚集的稳定剂也可制备功能化石墨烯薄片。这种薄片在血清等生理液体中稳定性高,且在高浓度(0.2mg·mL-1)下对MCF-7细胞基本没有毒性。负载阿霉素后,它能高效杀伤MCF-7细胞。同时明胶介导其体外持续释放,进一步提高疗效,为细胞成像和药物输送等生物医学应用奠定基础。除此之外,可基于功能化来赋予该载药体系良好的靶向性和控释性能。Zhang等对GO进行磺酸基衍生化,所得纳米载体用于两种抗癌药物(阿霉素和喜树碱)的共装载和靶向给药。该功能化GO共价结合叶酸(FA)分子后,可靶向FA受体过表达的人乳腺癌MCF-7细胞。该给药体系与单一载药体系相比,细胞毒作用显著提高,体现出临床中广泛采用的联合用药策略的优越性。他们还利用碳二亚胺介导反应将常见转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)偶联修饰到GO上。该复合物有效降低PEI自身的生理毒性,可递送质粒DNA或siRNA,其转染效率甚至高于PEI本身。荧光标记示踪证实该复合物能将质粒DNA定位在细胞核上。Pan等通过点击化学在石墨烯上共价接枝热响应的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)。聚合物含量达约50%,具备良好的溶解性和生理状态下的稳定性。由于石墨烯和PNIPAM间的相互作用,该复合物亲疏水性的相转移温度(33℃)较PNIPAM均聚物低。其也能通过π-π堆叠和疏水相互作用负载水溶性差的抗癌药物喜树碱,载药率15.6%(即每克复合物含0.185g喜树碱)。该复合物可能成为有效的药物递送和控释载体,自身不表现出毒性,载药后能杀伤癌细胞,且体外释药72h后才达到饱和。为了综合利用石墨烯和其他纳米结构的特殊功能,目前基于石墨烯的纳米氧化物复合材料也已成为众多的科学工作者研究的热点。Yang等通过简单的化学沉淀法能制备超顺磁性的GO-Fe3O4纳米复合物。原子吸收光谱研究表明其中Fe3O4含量约18.6%。尽管该复合物负载阿霉素的最大载药量只有1.08mg·mg-1,较直接以GO为载体时的载药量低一半以上,但其可在外磁场力作用下定向移动。该复合物在酸性pH下沉聚,碱性条件下则再分散成稳定的悬浮状态(图4)。这些特性满足药物靶向控释的需要。他们还将叶酸连接到GO-Fe3O4上,发展了分子受体-磁性的双靶向给药系统。负载阿霉素后,药物的释放明显地依赖于pH值。因此,该策略在提高靶向给药的同时实现pH敏感的智能控释。2.4石墨烯类的光敏剂石墨烯能强烈吸收近红外(NIR)光,是潜在的光敏剂。最近,Dai课题组研究了r-GO的近红外光热治疗特性。由PEG功能化的单层r-GO平均横向尺寸约20nm,其近红外吸收强度是聚乙二醇化GO的6倍。偶联精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)靶向肽后,可选择性地被人胶质瘤细胞U87MG吸收,引发显著的细胞光消融效应。而在没有近红外辐射时,光热剂量的r-GO表现的体外毒性则很小。Liu课题组发展了其体内的光热治疗方法。静脉注射石墨烯后结合低功率近红外激光(2W·cm-2)照射小鼠的肿瘤部位,肿瘤显著消融,同时小鼠的生存时间也得以明显延长。值得注意的是,与金纳米材料和碳纳米管等其他近红外光热纳米材料比较,这类材料体积小、光热效率高且成本低。此外,石墨烯也可作为其他光敏剂的载体,用于癌症的光动力学治疗。如甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰GO被用于负载光敏剂酞菁锌,负载