液相色谱操作

--PAGE1-123是代1是在（2是可溶性的杂质（也就是说这些杂质在配置样品时一样可了我们使用HC（最简单的办法是在做过样品后用强洗脱能力的流动相看能否再洗脱下来东西）1、样品过滤器（过滤不溶性杂质2、萃取小柱（过滤可溶性杂质或富集作用）流动相的处理（我们建议HPLC系统的所有流动相都采用UV级试剂流动相应通过0.45um的有机滤膜进行过滤（专用溶剂过滤瓶，隔膜将过滤后的流动相在超声波清洗器中进行15-20分钟的脱气（待用）流动相进入液相色谱泵时应经过2um的流动相过滤头过滤（一般仪、阀最常见的问题就是1单向阀中形成了一个气室（有一个小气泡在单向阀2由于流动相的3（0分钟，情况应该就有所好转，对于第三种情况就只能换单向阀了。2、柱塞密封在液相色谱泵头中是非常重要的国外是要求每500个小时就要更、0了负值就不能够真实的反映压力，应该及时的联系生产厂家进行维修。系统出了问题，应该马上联系生产厂家进行维修。m6个当量的稀硝酸里超声清洗）通常我们从液相色谱泵到进样阀之间的管路内径为0.02英寸，我们的流动相经进样系统常用消耗产的I进样阀，基本上各家仪器所配的手动进样阀都是罗丹尼的。罗丹尼进样阀前面有一个进样口，后边有6个口，分别接的是1，4之间是定量环，2接泵，3接柱子，5，6是费液。在LOAD状态样品由进样口进入1，4定量环，定量环满后样品5流出；当进样阀搬到INJECT状态时从泵来的流动相到2再到1带着样品经过4，3到了色谱柱进行分离，在INJECT状态下如果把样品从进样口注入，则直接从6排出，不会进入定量环和色谱柱。用手动进样阀进样时，分为满环进样和部分进样，一般满环进样需要进定量环倍以上体积，才能得到一个比较好的重现性，通常l的定量环我们用的进样针进样ll的玻璃的进样针进l时是比较准确的。HATON费液管和定量环的最高点在同一个水平面，防止定量的不准确。能够有效的延长色谱柱3的寿命色谱保护系统常用消耗1、在线过滤器它主要的功能是过滤样品中不溶性杂质，它里边的筛板一般0.2-2um可选，最常用的2um的；当没有接色谱柱时都有很高的压力时清、m粒径的保护柱保护m粒径的色谱柱，过我在这里要讲一下液相色谱柱的保养和再生：（至少要0倍柱体积，正相柱最好保存在正己烷和异丙醇：）的条件下，最好每月冲洗一到两次。色谱柱当用到一定的时间后会出现柱效下降，可以做一次简单的再生分析样品时用纯有机流动相硅胶柱：20正己烷-20二氯甲烷-20乙腈-15二氯甲烷-10正己氰基、氨基柱：20二氯甲烷-20异丙醇-20甲醇-15异丙醇-10二氯甲烷：20乙腈-20二氯甲烷-20正己烷-15二氯甲烷-10乙水或水/有机混合流动相时反相柱（C2、C4、C8、C18、苯基A：常用方法：20去除缓冲盐的流动相-20乙腈-20二氯甲烷-15乙腈-10去除缓B：生物/蛋白类：20去除缓冲盐的流动相-运行一个梯度洗脱（A：0.1%的三氟乙酸水溶液B：0.1%三氟乙酸在1：2的乙腈比异丙醇溶液）30分钟内B到100%--0.1当量浓度的稀硝酸：异丙醇（1：4）运行40倍柱体积（不能用GPC柱）-101：4的水/异丙醇20缓冲盐溶液-20HPLC水-20倍0.1MEDTA-20HPLC水-20乙腈-20氰基柱：20HPLC水-20乙腈-20二氯甲烷-15乙腈-10水系统也是非常重要的。格较贵，国产柱温箱的恒温效果稍差，但是除了示差外基本都能满足工作。色谱柱把样品经过分离后进入检测器检测，我们最常用的检测器是紫外检测器，（由于它灵敏度与教多的限制正在逐步被蒸发光散射检测器所取代荧光检测器，蒸发光散射检测器。我们这里只是讲一下UV检测器40用0后能量会迅速m纯甲醇的条件下比值应在0氘灯的能量已经不足了。样品池的清洗：主要是将色谱柱和保护柱取下，将进样阀和检测器直接连接用个当量的稀硝酸冲洗0分钟，然后用纯水冲0分钟再用甲醇冲0不能冲洗干净，可放到超声波清洗器中超声0受压力只有，如果压力过高就会将检测池冲爆，到时就只有更换。溶剂回收、样品回收装样品经过HC谱图来分析问题出在什么地方。怎样解决。问题一，色谱峰不宽样品的浓度过高（稀释检测器流通池体积过大（通常用于分析用的流通池是9ul的，不能将制（重新检查所有的接头有没有到位通常由泵到进样阀是采用.2英寸的不锈钢管，由进样阀到色谱柱采用.1英寸的管子，由色谱柱到检测器用.1英寸或更细的管子。样品在进样阀中扩散（通常是进样的前后打进了气泡造成的柱效差（更换新色谱柱保留时间过长（在满足分离度的前提下，提高流动相的洗脱能力（.H际上并不被认可）检测器还没有平部分峰重叠（有可能前一针的峰和后一针的峰重叠了鬼峰（也就是突然多出来的峰（冲洗柱子。（少进样量）流动相中缓冲盐对色谱柱的氧化（每天做完实验必须冲洗色谱柱样品中有未知的干扰组分（根据需要处理负存在于示差检测器中溶剂吸收能力小于流动紫外检测器中流动相的紫外吸收小于流动某种组分的影响（受激发，或紫外吸收小于流动相双峰（肩峰柱清洗筛板或更换保护柱芯有干扰组分—对样品进行前处理或更换色谱柱与流动相达到分也有可能是前一针的峰现在刚出进样量过大，色谱柱超载减小进样色谱柱塌陷有空隙或单向阀有回流更比如流动相是90醇（建议在有可能的情况下尽量用接近流动相的试剂来配置样品）样品体积太大通常我们要求进样的体积小于柱体积的转子密封泄露—更换进样阀转子密峰前色谱柱有塌陷修补或更进样量过大，色谱柱超载减小进样峰拖前面的峰没有出（情况）硅胶基质的色谱柱在高PH值的流动相下降解（选用特殊的色谱柱或高硅胶柱在高温下降解（通常我们使用硅胶基质的色谱柱温度不超过度死体积的存在（检查自进样阀以后的所接头色谱柱有死体积——更换或修尖峰（直上直下的峰就会膨胀出小气泡进入检测器-所以所有的高压混合装置的检测器出口都应该有背压调节器色谱柱存放时没有堵死色谱柱两端，内部干涸了。用甲醇冲问题二泄接头松了，或者卡套要更换检测器密封处泄转子密封坏问题三重现性差进样器（自动）流路堵检测器衰减设置太前面的样品吸附在进样系统或色谱柱中现在被冲了下定量不准（用大的注射器进更多的样，最后不要推到底峰的检测范围在检测器的线性范围以样品在制备过程中有丢问题四保留时间的变化含缓冲盐的流动相还没有平衡（或缓冲盐浓度不够色谱柱受到了污染（再生，或更换梯度系统平衡时间不够或流动相的极性改变后还没有平衡（衡的）流动相没有混合均样品在色谱柱中的吸附还没有平流动相中有挥发成色谱柱温度没有恒谱柱（变短）泵的流速不稳样品在色谱柱中满负荷—减少进样量；用直径更粗的色谱流动相的PH值过高或过低建议硅胶基质的色谱柱使用范围在2-8之流动相配置时有所改样品与色谱柱有反应-不能被洗脱（换更强的洗脱流动相问题六平衡问议用短链的离子对试剂，或平衡更长的时间。梯度系统色谱柱的平衡时间不离子对试剂平衡时间不够——一般离子队试剂需要50倍柱体积的冲洗才能流动相的平衡时间不问题七基线问无样品峰时跳动流动相中有气泡或样品极性与流动相极性差别太基线漂移—梯度洗脱中流动相某种组分的紫外吸收比较色谱柱有污染或流通池有污基线呈波浪形