江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的化冻条件优化

江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的化冻条件优化

芋头是天南星科多年生草本植物的一种多年生草本植物。它具有较高的营养和医疗价值。现在它是中国出口的重要蔬菜。芋头按种芽的颜色可分为红芽芋、白荷芋和紫荷芋3个品种［1］。红芽芋(Colocasiaescu-lentaL.Schottvar.cormosus‘Hongyayu’)是江西省铅山县传统优势产品,其碳水化合物含量较高,脂肪含量较低,蛋白质、维生素及矿物质元素含量丰富,营养价值高,具有良好的食用价值和开发前景［2］。江西铅山红芽芋种植历史悠久［3］,2007年它已获得国家无公害绿色食品证书,并被中国绿色食品委员会和农业部命名为“红芽芋全国绿色食品标准化生产基地县”［4］;2012年铅山县红芽芋种植面积发展到6800hm2,该县也因此成为华东地区规模最大的红芽芋基地。但目前,江西铅山红芽芋种质资源保存仍采用大田保种的方法,不仅需要投入大量的人力、物力和财力,而且还不可避免地会受到各种自然灾害(如病虫害、干旱、低温等)和人为失误(疏于管理、挂错标签等)的影响,最终可能造成江西铅山红芽芋特有种质的遗失或混杂。因此,探索江西铅山红芽芋种质资源超低温保存的方法具有十分重要的意义。体细胞胚状体发生途径是植物再生的一种有效途径,它可以在短时间内萌发出大量的体细胞胚应用于生产［5］。同时,一个成熟的再生体系是转基因的重要基础,一个良好的受体系统更是实现转基因的重要前提,胚性愈伤组织就是一种良好的转基因受体［6］。然而有研究表明,组织细胞在不断的再培养过程中,会发生染色体和基因型的变异,如产生多倍体、非整倍体、染色体消失及基因突变等现象［7］。超低温保存技术是目前唯一可行的、不需继代的种质资源长期保存方式［8］。超低温保存是指在-196℃(液氮)下保存植物材料,可以降低甚至完全抑制植物材料生活力及基因变异可能性,因此能够保持植物材料的遗传稳定性［9］。近年来出现的包埋玻璃化法是在玻璃化法和包埋脱水法基础上发展起来的超低温保存植物种质的新技术,它兼容了两者保存种质资源的优点,显示了巨大的应用潜力［10］。包埋玻璃化法具有能同时处理大量材料、对材料的毒害作用较小、处理后材料恢复生长快及成芽率高等优点［11］,在国内已成功应用于怀山药［12］、怀地黄［13］和甜柿［14］等作物。目前,关于芋头的超低温保存报道较少。Taka-gi等［15］和Rajnesh等［16，17］分别报道了芋头茎尖的玻璃化超低温保存,在国内尚无芋头超低温保存的报道,也未见红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存的研究。本文以江西铅山红芽芋的胚性愈伤组织为对象,研究了包埋玻璃化冻存过程中各因素对细胞活力和愈伤组织成活率的影响,拟建立江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存体系,为长期安全保存江西铅山红芽芋种质资源,以及进一步建立其遗传转化体系和定向改良江西铅山红芽芋种质奠定良好的基础。1材料和方法1.1schottva自罗胺schott脱毒苗来源江西铅山红芽芋(ColocasiaesculentaL.Schottvar.cormosus‘Hongyayu’)脱毒苗(由江西省江天农业科技有限公司提供)。1.2方法1.2.1tdz剂量将江西铅山红芽芋脱毒苗的球茎切成1~2mm厚,分别接种到诱导培养基上。诱导培养基为MS+2mg/LTDZ+1mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂,pH5.8~6.0。暗培养,温度为25±1℃。每天观察愈伤组织诱导情况,记录愈伤组织出现的时间、数量、颜色及其生长情况。60d后,选取浅黄色果冻状的胚性愈伤组织继代2次,每次30d。1.2.2红芽芋胚性愈伤组织块的制备参照Hirai和Sakai［18］的方法进行改良。包埋过程:(1)温度条件为25±1℃,将约0.2g的红芽芋胚性愈伤组织块转入含2%海藻酸钠和1mol/L蔗糖的MS培养基中后,再把包含胚性愈伤组织的混合物滴入含有0.1mol/LCaCl2和1mol/L蔗糖的MS液体培养基中30min,以充分形成直径约4mm的球形包埋珠(每个包埋珠含1个胚性愈伤组织块);(2)在无菌条件下,取出包埋珠,用MS+2mg/LTDZ+1mg/LNAA液体培养基洗涤并用无菌滤纸片吸干后,分别将包埋珠转入MS+2mg/LTDZ+1mg/LNAA+0~1mol/L蔗糖的液体培养基中(预培养1d),和MS+2mg/LTDZ+1mg/LNAA+0.75mol/L蔗糖的液体培养基中(预培养0~7d)。预培养条件:光照时间14h/d,光照强度1000~2000lx,温度为25±1℃;(3)将包埋的红芽芋胚性愈伤组织块在25±1℃下转入装载液(MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖)中0~90min;(4)红芽芋胚性愈伤组织块装载后,再用玻璃化保护剂PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4mol/L蔗糖,pH5.8)在0℃和25℃下分别脱水0~90min;(5)将包埋脱水后的红芽芋胚性愈伤组织块转入冷冻管中,更换新的PVS2,然后再迅速置于液氮中保存1d;(6)从液氮中取出冷冻管,分别放入25℃、30℃、37℃和42℃中水浴化冻3min;(7)化冻后,用MS+2mg/LTDZ+1mg/LNAA+0~1.6mol/L蔗糖的液体培养基将红芽芋胚性愈伤组织块在25±1℃下洗涤3次,每次10min。1.2.3细胞活力的测定采用TTC法［7］对洗涤后的红芽芋胚性愈伤组织块进行细胞活力的测定。细胞活力=(超低温保存后胚性愈伤组织TTC值/未超低温保存胚性愈伤组织TTC值)×100%。1.2.4胚性愈伤组织块的恢复培养将洗涤后的红芽芋胚性愈伤组织块转入分化培养基(MS+2mg/LTDZ+1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂)中进行恢复培养,培养条件:(1)光周期培养。光照时间14h/d,光照强度1000~2000lx,温度为25±1℃;(2)在25±1℃下暗培养7d后再转入光周期培养。光周期培养条件同(1)。60d后统计胚性愈伤组织块的成活率及恢复生长的时间。红芽芋胚性愈伤组织块的成活以其能分化出胚状体为标志。成活率=(超低温保存后胚性愈伤组织分化出胚状体的块数/超低温保存后胚性愈伤组织的总块数)×100%。1.2.5再生苗的形态性状和染色体数目的测定以未进行超低温保存处理的红芽芋胚性愈伤组织块为对照,将超低温保存后的红芽芋胚性愈伤组织块接入分化培养基,30d后将分化出的胚状体再次转入分化培养基,分化培养基为MS+2mg/LTDZ+1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。60d后对分化出的再生苗进行形态性状和染色体数目的检测。形态性状包括株高、芽数、根数、根长等。染色体数目的检测采用根尖压片的方法［19］。1.2.6活力和成活率研究以上实验均设置3次重复,所有数据表示为Mean±SD。在统计处理细胞活力和成活率的实验数据时发现,大部分数据不在30%~70%范围内,为提高显著性检验的精确度,我们对本文细胞活力和成活率数据进行反正弦转换,然后用SPSS19.0软件进行One-WayANOVA分析,再进行LSD法检验。2结果与分析2.1蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织的预培养从表1可知,预培养对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存具有显著影响。当用0~1mol/L蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织预培养1d时,结果表明,随着蔗糖浓度的提高,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著增加,但当蔗糖浓度超过0.75mol/L时,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率显著下降。当用0.75mol/L蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织预培养0~7d时,结果表明,预培养时间过长,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率显著下降,适宜的预培养时间为1d。因此,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的适宜预培养条件为0.75mol/L蔗糖预培养1d。2.2蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织的冻后活力和成活率的影响从表2可知,装载时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存具有显著影响。当用2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织装载0~90min时,结果表明,随着装载时间的延长,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著增加,但当装载时间超过40min时,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著下降。因此,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的适宜装载时间为40min。2.3脱水时间对红芽芋胚性愈伤组织的影响从表3可知,脱水时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存具有显著影响。当用PVS2对红芽芋胚性愈伤组织脱水0~90min时,结果表明,随着脱水时间的延长,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著增加。但当在25℃脱水时间超过30min或在0℃脱水时间超过60min时,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著下降。由于25℃PVS2脱水30min的细胞活力和成活率大于0℃PVS2脱水60min的细胞活力和成活率,故江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的适宜脱水条件为25℃PVS2脱水30min。2.4不同水浴化冻温度对红芽芋胚性愈伤组织细胞活力和成活率的影响从表4可知,化冻温度对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存具有显著影响。将红芽芋冻后胚性愈伤组织置于不同温度(25℃、30℃、37℃和42℃)下进行水浴化冻并检测其细胞活力和成活率,结果表明,随着化冻温度的增加,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著增加。但当化冻温度超过37℃时,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著下降。因此,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的适宜化冻温度为37℃。2.5蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织的影响从表5可知,洗涤液蔗糖浓度对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存具有显著影响。用0~1.6mol/L蔗糖对红芽芋冻后胚性愈伤组织进行洗涤并检测其细胞活力和成活率,结果表明,随着蔗糖浓度的增加,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著增加。但当蔗糖浓度超过1.2mol/L时,红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著下降。因此,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的适宜洗涤条件为1.2mol/L蔗糖洗涤10min。2.6培养光周期中的后胚性愈伤组织的培养从表6可知,冻后培养条件对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存具有显著影响。当红芽芋冻后胚性愈伤组织直接置于光周期中培养或先暗培养7d再转到光周期中培养时,结果表明,先暗培养7d再转到光周期中培养有利于提高红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率。因此,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的适宜冻后培养条件为先暗培养7d再转到光周期中培养。2.7计算参数2对红芽芋胚性愈伤组织冻后再生苗与对照再生苗的染色体数目进行检测发现,两者染色体数目相同(2n=28)。另外,从表7和图1可知,红芽芋胚性愈伤组织冻后再生苗与对照再生苗在平均株高、平均芽数、平均根数和平均根长等形态性状指标上虽有差异,但未达显著性水平(p>0.05)。这些结果表明,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存是可行的,基本不会影响其遗传稳定性。3材料的装复条件对愈伤组织生长的影响包埋玻璃化超低温保存的基本程序一般包括预培养、装载、脱水、化冻、洗涤及恢复培养等过程。影响植物种质包埋玻璃化超低温保存的因素很多,除材料本身外,还有保存所用试剂的种类、浓度和处理时间等。因此,要进行红芽芋包埋玻璃化超低温保存,需对以上步骤的具体影响因子进行优化。预培养一般是使用高浓度的蔗糖对材料进行培养。甜柿休眠芽茎尖在含有0.3mol/L蔗糖的改良MS培养基(KNO3和NH4NO3减半)上预培养1d,其成活率接近100%［14］。怀地黄带芽茎段在MS+0.4mol/L蔗糖+50g/LDMSO+10g/L乙酰胺培养基中4℃低温下预培养3d,成活率和再生率分别为66.93%和26.67%［13］。怀山药带芽茎段在MS+0.1mol/L蔗糖+0.1mol/L甘油培养基中4℃低温下预培养3d,成活率可达64.29%［12］。青岛百合茎尖在MS+0.4mol/L蔗糖+100g/L海藻糖+1mg/LABA的培养基上预培养3d,用TTC法检测存活率可达67.5%［20］。本实验结果表明,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织在25℃下转入MS+2mg/LTDZ+1mg/LNAA+0.75mol/L蔗糖的培养基中于14h/d光周期下预培养1d,细胞活力和成活率也可达到90%和60%以上。在预培养之后,植物材料一般要用甘油和蔗糖等混合物在25℃下进行装载,并且装载液的种类和装载时间也因植物种类而不同。当装载液为MS+1mol/L蔗糖+2mol/L甘油时,高山红景天茎尖适宜的装载时间为60min［21］。怀山药带芽茎段最适宜的装载液是MS+0.2mol/L蔗糖+2mol/L甘油+50g/LDMSO,装载时间为60min［12］。当装载液为MS+0.9mol/L蔗糖+2mol/L甘油时,树莓茎尖适宜的装载时间为90min［22］。本实验结果表明,江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的装载液是2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖的MS混合物,较适宜的装载时间为40min。。玻璃化保护剂是保证植株再生的关键。玻璃化保护剂一般选择PVS2,其脱水温度和脱水时间对愈伤组织成活率有较大影响。高山红景天茎尖的玻璃化保护剂为改良的PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+15%聚乙二醇+1mol/L蔗糖),适宜的脱水温度为0℃,脱水时间为180~210min［21］。怀地黄带芽茎段的玻璃化保护剂为PVS2,适宜的脱水温度为0℃,脱水时间为30min［13］。怀山药带芽茎段的玻璃化保护剂为改良的PVS2(30%甘油+15%乙二醇+10%二甲基亚砜+15%聚乙二醇+0.4mol/L蔗糖),适宜的脱水温度为0℃,脱水时间为60min［12］。青岛百合茎尖的玻璃化保护剂为PVS2,适宜的脱水温度为0℃,脱水时间为60min［20］。甜柿休眠芽茎尖的玻璃化保护剂为PVS2,但其适宜的脱水温度为25℃,脱水时间为120min［14］。沙生柽柳休眠茎尖的玻璃化保护剂为改良的PVS2(40%甘油+0.4mol/L蔗糖+10%聚乙二醇+5%二甲基亚砜),适宜的脱水温度为25℃,脱水时间为20min［23］。灰杨休眠茎尖的玻璃化保护剂为改良的PVS2(40%甘油+0.4mol/L蔗糖+10%聚乙二醇+5%二甲基亚砜),适宜的脱水温度为25℃,脱水时间为20min［24］。江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的玻璃化保护剂是PVS2,适宜的脱水温度为25℃,脱水时间为30min,此结果与甜柿、沙生柽柳和灰杨的实验结果相类似。冻存材料在保存终止后需快速化冻,以防止由于次生结冰对组织和细胞造成的伤害。一般来讲,冻存材料在进行包埋玻璃化超低温保存后,适宜的化冻条件为37~40℃水浴快速化冻。甜柿休眠芽茎尖［14］、高山红景天茎尖［21］、怀地黄带芽茎段［13］、怀山