小麦amlo-1ac基因表达的初步研究

小麦amlo-1ac基因表达的初步研究

meo是通过图位突变法获得的大麦抗凝剂。随后Devoto等在水稻、拟南芥及其它一些植物中相继克隆了Mlo类似基因。Elliott等报告了小麦Mlo类似基因,并证明该基因与小麦抗白粉病有关。目前,小麦Mlo基因家族中已有6个全长基因和2个近全长基因在GenBank中登录,包括我们克隆的3个小麦Mlo基因(TaMlo-A1c,TaMlo-B1c,TaMlo-B1d)。TaMlo-A1c基因是小麦Mlo家族中的重要成员,Yu等证明了TaMlo-A1c是膜结合蛋白,属于具有7个跨膜结构域的植物特有的Mlo家族。Southern杂交表明TaMlo-A1c基因在小麦每个基因组中有1个拷贝。利用中国春缺失系将该基因定位在2AL、2BL和2DL的特定区段上。Northern杂交研究了该基因在白粉菌诱导后不同时间小麦叶片中的表达,但它在小麦其它器官中的表达还未见报道。Northern杂交是研究基因在转录水平表达的常规方法,一般以稳定表达的18srRNA作为对照。Actin是植物中的一个稳定表达的“管家基因”,在研究大麦和大豆基因转录水平中,尤其在RT-PCR中常用它作为对照。半定量RT-PCR方法以特异性高、操作简便和可靠性强的优点,在研究基因表达方面有逐渐取代Northern杂交的趋势。为了更深入研究小麦TaMlo-A1c基因的抗白粉病机制。本研究利用半定量RT-PCR方法,以小麦Actin基因作为对照,对小麦TaMlo-A1c基因在各个不同器官中的表达进行了研究。1材料和方法1.1不同光照、时间对小麦根系诱导的菌株试验材料为小麦抗白粉病品系“99-2439”,将其种子播于培养皿中,用透明投影胶片与外界隔离以防止白粉菌孢子落入,在人工气候箱中按光照12h、黑暗12h光周期,18～20℃下培养。在幼苗长至一叶一心时,接种白粉菌,在接种后不同时间(1、4、12、24、48和72h)分别取小麦的幼叶、根、诱导的根;小麦的壮叶、旗叶、幼穗、幼茎取自温室培养(15～25℃)的未人工接种白粉菌的“99-2439”材料。1.2关于总rna的检测用TRIzol○R(Invitrogen,USA)试剂分别提取小麦幼叶、壮叶、旗叶、穗、茎、根等的总RNA。(1)定量:测260、280nm处的吸光值,计算A260/A280的值,估计总RNA的纯度,通过A260的值分别对不同器官的总RNA进行定量。(2)RNA完整性的检测:在1%普通琼脂糖凝胶上分离总RNA,若有4条(代表rRNA等)清晰无拖尾的带,则说明总RNA完整。1.3合成第一链生物网络roche,ge建立取等量不同器官的总RNA,用试剂盒“1stStrandcDNASynthesisKitforRT-PCR”(Roche,Germany)合成第一链cDNA。1.4semi-qt-pcr1.4.1pcr扩增条件根据小麦Actin基因(GenBank查询号:gi:48927617)序列,设计了一对特异性引物:WAC-F:5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′;WAC-R:5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′。PCR扩增采用25μL反应体系,分别加入等量不同器官的cDNA(3μL)模板,1倍的PCR缓冲液(10mmol/L的Tris-HCl,pH8.5～9.0,50mmol/L的KCl,0.1%的Triton-100),200μmol/L的dNTP,1.5mmol/L的MgCl2,0.4μmol/L的Actin基因特异引物,1UTaqDNA聚合酶。反应在Perkin-Elmer9600热循环仪上进行。反应程序:94℃预变性3min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,18个循环;72℃延伸5min。小麦Actin基因扩增产物长度为422bp。取等体积的PCR产物加上样缓冲液经1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯观察照相。1.4.2特异性引物pcr扩增根据已克隆的小麦TaMlo-A1c基因(GenBank登录号:AF384144)序列,设计了一对特异性引物,F1:5′-GATTCATCTCGCTGCTGC-3′;R1:5′-TGGCTGTCTGCTCGTCAAAG-3′。PCR扩增条件同1.4.1,其扩增产物长度为1050bp。取等体积的PCR产物加上样缓冲液经1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯观察照相。2结果与分析2.1小麦actin、tamlo-a1c基因的表达TaMlo-A1c基因是通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系中克隆的,TaMlo-A1c基因的Northern杂交结果表明,TaMlo-A1c基因在未诱导的小麦易位系叶片中有一定量的本底表达,小麦白粉菌诱导12h之后,表达水平有所提高,诱导24h后保持这一表达水平,诱导48h后表达水平下降,诱导72h后表达水平进一步下降(图1)。用半定量RT-PCR方法对小麦TaMlo-A1c基因进行表达分析,结果表明(图2),小麦Actin基因和TaMlo-A1c基因分别得到与预期片段大小一致的特异性扩增产物。Actin基因在白粉菌诱导后不同时间的叶片中扩增条带亮度基本相同。以此为对照,分析了叶片中小麦TaMlo-A1c基因在白粉菌诱导后不同时间的表达变化。发现TaMlo-A1c基因在未诱导的小麦抗白粉病品系“99-2439”叶片中有一定量的本底表达,当小麦白粉菌诱导12h之后,表达水平稍微有所提高,诱导24h后保持这一表达水平。同时利用半定量RT-PCR方法对小麦类受体蛋白激酶基因(TaLRK,GenBank登录号:AY584533)的表达进行了分析,结果表明,该基因在白粉菌诱导12h后的叶片中表达水平明显增强,诱导24h后表达水平进一步增强(图2)。进一步验证了以小麦Actin基因作为对照,利用半定量RT-PCR方法研究小麦基因表达的可行性。2.2小麦幼苗根中tamlo-a1c基因的表达用半定量RT-PCR方法对TaMlo-A1c基因在小麦不同器官中的表达进行了分析(图3)。结果表明,TaMlo-A1c基因在小麦幼叶、壮叶、旗叶、幼茎、根、白粉菌诱导的根中都表达,幼穗中不表达。它在叶中的表达水平明显高于茎和根,茎中的表达水平稍微高于非诱导根。且该基因在白粉菌诱导的根中表达水平有所提高。由此可见小麦TaMlo-A1c基因表达强度依次为叶、茎、根,在穗中不表达。3半定量rt-pcr方法TaMlo-A1c是与小麦抗白粉病有关的重要负调控基因。Yu等以18srRNA为对照用Northern杂交方法,对白粉菌诱导后不同时间小麦叶片中TaMlo-A1c基因的表达研究证明,该基因在白粉菌诱导后的叶片中表达稍微有所增强。由于Northern杂交所需RNA量较多(一般为20μg),操作复杂、费时,需放射性同位素,对于序列高度相似的小麦Mlo基因家族,不可避免地产生交叉杂交,不能真实反应一个基因的表达变化。为了解TaMlo-A1c基因在小麦不同器官中的表达,本研究利用半定量RT-PCR方法,只需5μg的总RNA。根据TaMlo-A1cActin基因cDNA片段,设计了针对小麦TaMlo-A1c和Actin基因的特异性引物,通过半定量RT-PCR对TaMlo-A1c基因在小麦不同器官中的表达进行了研究。结果表明TaMlo-A1c基因在小麦叶、茎、根中均表达,表达强度依次为叶、茎、根,在穗中不表达。对白粉菌诱导后不同时间小麦叶片中TaMlo-A1c基因的表达分析表明,该基因在白粉菌诱导后表达稍微有所增强,与Yu等的Northern杂交结果一致。综合以前的研究认为,尽管小麦TaMlo-A1c基因在Bgt诱导后转录水平有所变化,但其实质性的表达调控是在翻译水平。同时本研究证明了Actin基因在小麦不同组织中表达稳定,可以作为小麦基因表达研究的对照。半定量RT-PCR是目前研究基因转录水平的有效手段,可用来检测基因表达及其变化状况,并可进行定量分析,与传统的Northern杂交相比较,具有特异性高、操作简便、可靠性强的优点。在植物基因表达研究方面得到了广泛应用。万平等以微管蛋白基因(Tubulin)为对照,利用半定量RT-PCR,研究发现小麦锌指蛋白基因(TazF)属于组成型表达基因。王维平等以水稻肌动蛋白基因(Actin)为对照,利用半定量RT-PCR研究,发现水稻RCOI1基因的表达受茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导。同时半定量RT-PCR方法在病原体检测、转基因的安全检测及肿瘤的研究方面得到了广泛的应用。运用半定量RT-PCR方法研究小麦基因在转录水平的表达,需注意以下几点:(1)总RNA和cDNA的质量。只有在总RNA未被降解的情况下,才能保证其中mRNA的完整性和随后反转录的cDNA质量,从而真实反映基因的表达。(2)总RNA的定量。在反转录之前,作为起始模板各个样品中的总RNA量要一样,cDNA量和电泳PCR产物量也要一样,才能保证