壳聚糖与茜素红s的还原峰峰电流关系

壳聚糖与茜素红s的还原峰峰电流关系

1壳聚糖的应用地壳聚糖（cts）是脱乙酰亚胺的多糖。这是甲壳素n-脱甲基糖的产物。这是自然界唯一的碱性糖。它具有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纤性、吸湿性及保湿性。因此,壳聚糖在纺织印染、造纸、食品、化妆品、污水处理及医用材料等工业中有着很广泛的应用。同时,壳聚糖及其衍生物还是很重要的生物活性物质,具有抗肿瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂和增强免疫力等功能。此外,壳聚糖在分析化学的应用也很广泛。所以建立测定壳聚糖的方法非常重要。已有文献报道利用茜素红S、锌试剂等光度法测定壳聚糖,但电化学测定壳聚糖的报道甚少。本实验利用壳聚糖和茜素红S(ARS)生成非电活性复合物这一特征,建立了测定壳聚糖的电化学方法。2实验部分2.1仪器和溶液制备JP-303型极谱分析仪(成都仪器厂);三电极系统:滴汞电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝为对电极;CV-50W电化学分析仪(美国BAS公司);JM-1型悬汞电极(江苏电分析仪器厂)为工作电极;PHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂);UV-2501紫外可见分光光度计(日本岛津公司);RF-5301荧光分光光度计(日本岛津公司)。壳聚糖(CTS,脱乙酸度85%,相对分子质量以5×105计,sigma公司):1000mg/L。准确称取壳聚糖0.1000g溶于100mL质量分数1%HAc溶液作为贮液。移取贮液12.5mL定容至250mL作为操作溶液(50mg/L);ARS:5.0×10-4mol/L;0.2mol/LHAc-NaAc缓冲溶液;所用试剂均为分析纯,实验用水为3次蒸馏水。2.2电化学和光谱分析在10mL的比色管中,依次加入2.0mL0.2mol/L,pH5.0NaAc-HAc缓冲溶液,1.0mL5.0×10-4mol/LARS和不同浓度的CTS,用水定容,摇匀后静置25min,用电化学方法和光谱法进行研究和测定。3结果与讨论3.1cts浓度对cs活性的影响在pH5.0NaAc-HAc缓冲溶液中,ARS在-0.408V处(vs.SCE)有一对峰形良好的氧化还原峰(图1a曲线2)。当在体系中加入CTS后峰位置不变,峰电流却明显下降(图1a曲线3),这说明ARS和CTS生成了复合物,并且该复合物不具有电化学活性。在pH5.0的酸度条件下,CTS分子链上含有大量带正电荷的氨基,而ARS的羟基上的质子和磺酸基上的Na+离解后使分子带负电荷,两者之间可以通过静电引力结合;CTS大分子链上分布着许多羟基、氨基和一些N-乙酰氨基,在水溶液中会形成各种分子内和分子间氢键,这些氢键使CTS链形成一些疏水性空腔,ARS的芳香族基团可以通过疏水相相互作用不断进入空腔,由于CTS生物大分子的包围,使ARS的电活性基团隐藏在CTS的空腔内部难以在电极上发生还原反应,从而导致ARS的峰电流值下降。继而又进行了光谱实验,结果表明,随着CTS的浓度的增加,422nm处的吸收峰不断降低(图2a),吸光度的下降同CTS的浓度之间呈线性关系(线性回归方程为A=0.1946-0.00642CCTS,r=0.9991)。在相同的体系中,加入CTS后,513nm处的荧光强度不断降低(见图2b),产生了荧光猝灭,并且荧光猝灭程度F0/F与CTS的浓度之间呈线性关系(线性回归方程为F0/F=-2.576+1.830CCTS,r=0.9924)。这进一步表明ARS和CTS之间生成了复合物。3.2cts-ars检测在pH5.0的NaAc-HAc缓冲溶液中,用线性扫描二阶导数极谱法对体系进行测定,ARS有一个灵敏的二阶导数还原峰(图1b曲线1),峰电位为-0.408V;加入一定量CTS后,还原峰的电位不变而峰电流降低(图1b曲线2)。峰电流的降低值与加入的CTS量在一定范围内呈线性关系,因此可用于CTS含量的测定。3.3缓冲溶液峰电流与峰电流固定ARS和CTS的浓度,实验了邻苯二甲酸氢钾、B-R缓冲溶液、HAc-NaAc和六次甲基四胺等缓冲溶液,发现在NaAc-HAc缓冲溶液中峰电流稳定,并且峰电流降低明显。同时测定了pH值的变化对峰电流的影响,结果表明,pH在4.0～5.5范围内,0.04mol/LHAc-NaAc缓冲液用量为2.0mL时,峰电流降低值Δi″p最大(图3),本实验采用pH5.0NaAc-HAc缓冲溶液2.0mL控制体系的酸度。3.4ars用量的确定在pH5.0NaAc-HAc缓冲溶液中,固定CTS的浓度为4.0mg/L,考察ARS浓度变化对测定的影响,发现当ARS浓度较大时体系会出现暗红色沉淀,极谱波分裂成两个波峰,影响测定。当ARS浓度为5.0×10-5mol/L时,峰电流稳定且峰电流差值Δi″p最大(图4),所以本实验选择ARS的最佳用量为5.0×10-5mol/L。实验表明:反应25min后体系的峰电流稳定,并至少稳定2h。本实验选取反应时间为25min。3.5线性范围和检出限在选定的最佳条件下,测CTS的线性范围为0.5～7.5mg/L;线性回归方程为Δi″p(nA)=30.92+108.4CCTS(mg/L),r=0.9990;检出限为0.4mg/L。对4.0mg/LCTS溶液平行进行11次测定,其相对标准偏差为2.4%。3.6不同试剂对峰电流的影响在反应体系中(5.0×10-5mol/LARS+4.0mg/LCTS),添加不同试剂考察峰电流的变化。牛血清白蛋白(BSA)(5.0mg/L)对体系无影响;低浓度NaCl(0.1%)对体系影响不大;而较高浓度的NaCl(1.0%)和十二烷基苯磺酸钠(SDS,5.0g/L)以及曲通X-100(0.5%)对反应体系影响很大。3.7扫速v与ip的关系当扫速在100～1000mV/s范围内变化时,ARS(5.0×10-5mol/L)与ARS(5.0×10-5mol/L)+CTS(4.0mg/L)的i″p与扫速v均呈线性关系,线性回归方程分别为i″p(nA)=424.1+6.416v(mV/s)和i″p(nA)=280.8+4.521v(mV/s),相关系数分别为0.9991和0.9997。说明极谱波性质为典型的吸附波。3.8强烈的吸附性从电毛细管曲线可看出(见图5),在缓冲介质中加入ARS后,曲线明显下降(见图5曲线2),说明ARS在电极上有强烈的吸附性。当继续加入CTS时得到曲线3,明显比曲线2上升,体系的吸附作用减弱,说明ARS-CTS复合物在电极上的吸附性比游离态ARS的弱得多,并且络合物的存在对游离态ARS的在电极上的吸附作用影响很小。3.9壳聚糖的提取根据文献,将新鲜的虾壳、蟹壳内的肉质、污物尽可能剔除干净,烘干。准确称取一定量干燥的虾壳、蟹壳,经过浸酸、碱煮、氧化脱色、还原及脱乙酰基等步骤处理后获得壳聚糖粗制品(脱乙酰度8