葡萄线虫病与感病互作的关键时期

葡萄线虫病与感病互作的关键时期

ucinus（schw.）burr是一种危害葡萄园的永久性真菌疾病。目前,世界上所有种植葡萄的国家和地区的大多数主栽品种不抗病,这严重影响和危害了葡萄的生产。葡萄白粉病在我国吉林、辽宁、河北、河南、山东、山西、陕西、新疆、甘肃、四川、云南、贵州、江苏、安徽和台湾等省均有发生,尤以河北、山东等省及陕西秦岭北麓、新疆吐鲁番等葡萄产区受害最为严重。中国是世界葡萄起源的中心之一,存在大量的抗病资源,利用这些抗病资源对比研究白粉病菌侵染过程及其影响因素,确定抗病反应的关键时期,对于葡萄白粉病的防治、抗病基因资源利用有重要意义。但目前,国内尚未见葡萄白粉病侵染过程的相关报道,对葡萄植株抗病反应的关键时期尚不明确,葡萄植株对白粉病抗性存在差异的原因尚未探明。为此,本研究以抗病的中国野生葡萄白河-35-1和感病的欧洲葡萄佳利酿及其抗、感病后代株系为材料,比较了人工接种后葡萄白粉菌的侵染过程,以期探明葡萄抗病性反应的关键时期,为葡萄白粉病的防治奠定基础。1材料和方法1.1葡萄种质资源葡萄抗白粉病株系白河-35-1(父本)、感病品种佳利酿(母本)及其F1代抗病株系6-12-4和感病株系6-12-2,均采自西北农林科技大学园艺教学试验场葡萄种质资源圃。1.2学习方法1.2.1叶片的处理和接种试验分别于2005年和2006年6月下旬进行。在同一株感染白粉病的植株上采集病原叶片,参照王跃进等的方法人工接种白河-35-1、佳利酿、6-12-2和6-12-44个品种或株系新稍顶端2~4节位的叶片,每处理接种30个叶片,接种当日记为0d。待接种的新稍提前2周套袋隔离,防止田间自然病原侵染。接种前,对套袋隔离的待接种叶片上的白粉病病斑进行肉眼观察,并进行考马斯亮蓝G-250染色和解剖观察,统计叶片的自然带菌率,以未套袋隔离的叶片为对照。1.2.2数码显微镜观察在人工接种葡萄白粉菌后的0,1,3,5和7d,分别采集接种叶片,参照杨俊等的方法,对叶片表面的病原菌进行染色,脱色时间为20min,在数码显微镜下观察记录菌丝的生长状况。以接种后单个叶片为单位,通过解剖镜镜检统计接种叶片带菌率,每处理观察20个叶片,染色和观察方法同前。1.2.3组织切片观察在解剖镜下选取样品病斑部位并标记,用剪刀剪下,在FAA标准固定液中固定,然后制作石蜡切片,参考杨俊等的方法用考马斯亮蓝染色液染色30min,分色后观察病部的解剖结构。2结果与分析2.1感病植株田间自然带菌率检测结果表明,白河-35-1、佳利酿,6-12-4和6-12-2套袋隔离叶片均未发现肉眼可见的白粉病病斑。解剖镜镜检发现,在感病材料佳利酿、6-12-2上有极少数菌丝分布,未套袋隔离叶片(对照)菌丝检出率为20.0%,套袋叶片菌丝检出率为6.7%;在抗病材料白河-35-1、6-12-4的未套袋叶片上菌丝检出率为6.7%,套袋叶片菌丝检出率仅为3.3%。表明,抗病葡萄植株田间自然带菌率明显低于感病植株;在白粉病接种试验中,提前2周套袋隔离是必要的。2.2张量检测结果在接种后1d,4个不同抗性的葡萄株系均未发现肉眼可见的病斑,但显微观察发现所有接种叶片表面均有少量白色菌丝体和分生孢子,说明白粉病菌接种成功,孢子或菌丝体已经附着在接种叶表面(图1)。2.3在不同抗葡萄叶表面的生长过程中2.3.1菌株分布的特征结果(图1)显示,在接种后的0,1,3,5和7d内,葡萄白粉菌丝体在白河-35-1的分布极少,并且菌丝体集中分布在叶脉附近;6-12-4上的菌丝体数量在整个观察过程中始终和白河-35-1上的数量相同。随着接种后时间的延长,二者叶片表面的菌丝体数量未见明显变化,说明病原菌在抗病株系叶片表面的增殖较为缓慢。2.3.2生长植株的生长在接种葡萄白粉菌后0,1,3,5和7d内,感病品种佳利酿和6-12-2的被接种叶片上,白粉菌菌丝数量均随着接种后时间的延长而逐渐增加,但6-12-2上的菌丝数量始终略低于佳丽酿(图1)。感病株系叶片上的菌丝在接种后3d数量明显增多,菌丝开始以丝状连接在一起。比较病原菌在感病和抗病葡萄株系上的侵染过程可知,二者在人工接种葡萄白粉菌3d后表现出明显区别,即此时感病植株叶片表面菌丝开始大量生长,而抗病植株菌丝生长一直不明显。表明,病原菌和寄主的识别以及抗病材料的抗病反应,主要在接种后3d内完成。2.4在混合酶菌感染后，对各种抗葡萄叶的解剖观察2.4.1海绵组织的排列结果发现,白河-35-1叶片表皮的栅栏组织和海绵组织排列比较紧密,而感病品种佳丽酿的排列相对松弛(图2)。葡萄抗病和感病品种解剖结构的区别,可能是抗病性不同的原因之一。2.4.2不同葡萄叶片红酵母菌芽孢杆菌芽孢杆菌芽孢杆菌芽孢杆菌芽孢杆菌芽孢杆菌芽孢杆菌芽孢杆菌py由于抗性株系没有形成可供观察的病斑,因此本试验只观察了白粉菌菌丝对感病葡萄植株佳利酿的侵染过程。接种在佳丽酿叶片表面的白粉菌孢子(图3-A)在适宜的条件下萌发产生芽管(图3-B),芽管的顶端逐渐膨大而形成附着胞(图3-C),然后从附着胞上产生较细的侵染丝(图3-D,3-E),侵染丝穿过葡萄叶片的表皮组织后在细胞间扩展(图3-F,3-G)),部分菌丝寄生细胞后伸出叶片表面,并大量分支增殖(图3-H)。3主要影响因子的确定葡萄白粉病是葡萄的重要病害之一,比较白粉菌在不同抗性葡萄叶片上的侵染过程以确认侵染的关键时期,对于葡萄抗白粉病机制研究、克隆和利用葡萄抗白粉病基因以及葡萄白粉病的防治有重要意义。本试验结果发现,在自然田间条件下,不同抗病性的葡萄叶片表面自然带白粉菌的情况不同,抗性株系叶片表面基本不带菌,但感病株系叶片表面带菌率为20.0%,引起这一差异的原因可能与叶片表皮面结构、叶片代谢物质和叶围微生物有关,需进一步研究,以确定主要的影响因子。本研究发现,感、抗葡萄植株叶片横切面解剖结构存在明显区别,结合白粉菌侵染过程研究结果,作者推测这种表皮结构的差别可能与抗病性有关,值得进一步深入研究。在研究葡萄抗病基因时,人工接种诱导抗病基因的表达是常用的方法之一。但在大田自然条件下,病原菌的自然传播往往会干扰人工接种诱导。本研究观察到,在自然条件下,感病葡萄叶片自然带菌率高达20.0%,套袋隔离叶片的自然带菌率为6.7%,可见套袋隔离可明显降低待接种叶片的带菌率。若要完全避免病原菌自然传播对人工接种的影响,套袋隔离时间至少要在2周以上。对葡萄白粉病的侵染过程至今没有详细报道,一般认为子囊孢子是田间条件下最初的侵染源,而分生孢子是主要的二次侵染源,人工接种时一般不存在子囊孢子,因此分生孢子应该是人工接种后的侵染源。分生孢子的萌发和侵染过程受多种因素影响。人工离体培养葡萄白粉菌存在很多困难,因此研究田间人工接种后白粉菌的侵染过程,仍然是了解葡萄白粉菌侵染过程的主要途径。本研究通过对葡萄叶片表面白粉菌和病斑部位解剖结