体外经细胞因子扩增并回输前后恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞的变化

体外经细胞因子扩增并回输前后恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞的变化

自然损伤细胞（nk）是存在于人体的免疫细胞。在过去，由于技术原因，nk细胞的外部扩张很难达到临床治疗的数量。扩散混合淋巴结的nk样本（表面标记为cd16）20%的细胞只有10%20%。笔者采用改良的培养技术,一次扩增可以达30~50亿个混合淋巴细胞,主要含有CD4+、[作者简介焦顺昌,男,1984年第一军医大学毕业,协和医科大学1995级博士。电话:(010)66939761;E-mail:jiaosc@CD8+、CD16+、CD56+等细胞,其中带有NK样细胞标志的CD16+/CD56+细胞占20%~70%,可满足临床治疗的需要。但回输人体后对机体免疫功能有何影响?本研究试图回答这一问题。1数据和方法1.1病例选择及术后辅助治疗情况2007年3月-2008年6月于我院诊治的恶性实体瘤患者,选取资料完整的共22例。其中非小细胞肺癌8例、大肠癌3例、胰腺癌5例、余为卵巢癌、胃癌、肝癌、恶性黑色素瘤等;术后辅助治疗后8例,晚期患者14例。男17例,女5例;平均年龄为54.14±12.96岁(31~77岁)。1.2输注后细胞毒性检测1.2.1淋巴细胞体外扩增培养患者签署知情同意书后,采抗凝血约40mL,在GMP层流实验室进行扩增培养,见张国庆等采用方法。1.2.2回输方法培养好的混合淋巴细胞经质量控制合格后混悬于100mL生理盐水中,用带有滤膜的输液器缓慢静滴约1h,回输前可肌注苯海拉明20~40mg。回输前后及回输过程仔细监测生命体征及毒副反应。每次回输前抽静脉血做外周血淋巴细胞亚群检测。1.2.3淋巴细胞表型检测外周血淋巴细胞及体外扩增后淋巴细胞应用流式细胞术测定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56-、CD3-CD16+CD56+、CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16+CD56-、CD3+CD16+CD56+细胞在淋巴细胞中所占百分比的情况。1.2.4统计学方法使用SPSS10.0软件进行分析,数据以平均数±标准差(ˉx±s)表示(x¯±s)表示。2结果2.1细胞培养成熟时所得淋巴细胞的计数及增殖个数外周血淋巴细胞扩增培养平均时间为13.46±1.20d;细胞培养成熟时所得淋巴细胞数为(2.99±0.65)×109,扩增倍数为488.06±191.25;苔盼兰染色检测细胞存活率为97.71%±1.07%。2.2返回后的副反应分析22例患者经细胞回输治疗后生命体征及血常规、肝功能、肾功能等检查结果均无明显改变;回输后未出现不良反应。2.3表1显示了前后淋巴结的形态变化2.4表2显示了再利用率前后的出血前后阿什贝林亚组的形态变化2.5个体是否个体的配比选择5例多次回输的患者,观察多次回输后,不同次数回输后2周外周血CD16+/CD56+细胞的百分比。图1可以看出,不同个体间差距较大,不好比较;但针对每一个体观察,回输后外周血CD16+/CD56+细胞比例升高,而多次回输并未呈持续上升趋势,只是一直保持在较高状态。其他亚群比例并无变化。3cd18+/cd56+细胞回输的安全性分析如表1所示,外周血淋巴细胞在体外经细胞因子刺激并扩增后CD16+/CD56+(%)细胞比例显著升高,每次回输的细胞中CD16+/CD56+细胞占45.6%±18.8%。回输细胞在体内的寿命目前不详,但回输2周后外周血中仍可检测到CD16+/CD56+细胞显著升高达26.4%±13.9%(表2),提示回输的细胞在2周后仍有部分存活。以CD16+/CD56+细胞为主的NKTm细胞受MHC约束力较弱,对肿瘤细胞杀伤具一定广谱性,故回输后体内CD16+/CD56+细胞的增加有助增强机体抗肿瘤能力,有助打破肿瘤免疫耐受状态。一次回输,2周后仍可看到外周血中CD16+/CD56+细胞比例显著增高,提示NKTm细胞回输具有较高的效率,可有效提高机体抗肿瘤免疫功能。各项临床指标的观察显示,NKTm细胞回输是安全的,未见不良反应。表1显示,在1次回输后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞比例无显著变化,CD16+/CD56+细胞的增多亦未引起不良反应,表明NKTm细胞治疗在增强机体抗肿瘤免疫、克服肿瘤免疫耐受的同时,并未打破机体免疫平衡状态,不会引起免疫失衡所致的疾病,即使多次连续回输,CD16+/CD56+细胞一直维持较高水平但未持续上升,其他各亚群比例基本未变。该结果提示NKTm细胞连续多次回输是安全的。本研究显示NKTm细胞回输可以显著提高机体抗肿瘤细胞免疫功能,多次连续回输可以使这一功能保持在一个较高水平,有助于对体内肿瘤细胞的持续杀伤,且具有良好的安全性。存在问题:尽管初步研究显示出NKTm细胞回输具有一定抗肿瘤临床疗效,但严格设计的随机对照临床研究仍十分必要;完成这样的临床研