奶牛血清-羟丁酸含量检测方法的比较

奶牛血清-羟丁酸含量检测方法的比较

牛奶酮病也被称为祖母抑郁，是由沉积物和脂肪酸引起的能量代谢疾病引起的。在我国随着奶牛业的发展,奶牛酮病尤其是亚临床酮病的发病率有上升的趋势。酮病虽然很少引起奶牛死亡,但会使奶牛的泌乳量下降,乳质量降低,繁殖率降低以及引起生殖系统疾病和内分泌紊乱等多种疾病,增加了治疗费用,给奶牛养殖业造成严重的经济损失。因此,预防酮病、尽早发现和及时治疗酮病显得尤为重要,而亚临床酮病的检测则是重中之重。但实际生产中由于定量检测方法操作繁琐、成本高,而定性通讯作者:庞全海(1963-),教授,博导。韩一超(1960-),副研究员。4讨论在治疗期间,除生理盐水对照组外,其他3组病羊的体温(T)、呼吸(R)、脉搏(P)都有趋于正常范围的走向,说明宫得健水剂、宫得健凝胶剂、环丙沙星在子宫灌注治疗子宫内膜炎上都有疗效,但宫得健水剂组羊在治疗期间的第5天和第10天都表现出反弹现象,这可能是因为此时药物已被完全吸收,未被吸收利用的因努责而被排出,而宫得健凝胶剂的黏附和缓释作用,使药物依然有效。环丙沙星组在用药的初始,显现出比宫得健凝胶剂的效果要好一些,但随着时间的延长,药物的的检测方法准确程度又报道不一,给酮病的诊断带来很大的困难。目前判定亚临床酮病主要是检测血清中β-羟丁酸(BHBA)的浓度,一般认为血清BHBA含量大于1.0mmol/L时就可以判定为亚临床酮病。本试验以血清BHBA含量大于1.2mmol/L作为亚临床酮病奶牛的诊断标准,以期在现有的定性检测方法中筛选出一种准确度高、操作简单,在实际中可以广泛应用的检测方法。1材料和方法1.1试验牛奶营养和饲养选择晋南某奶牛场荷斯坦牛(年龄在4~10岁,胎次在2~6胎)96头作为试验奶牛,日粮配给按照围产期奶牛营养需要标准供应,TMR饲养技术饲喂。1.2临床病羊的生理指标BHBA检测试剂盒、亚硝基铁氰化钠、无水碳酸钠、吸收和代谢,其效果和宫得健凝胶剂基本相当甚至低于宫得健凝胶剂组,说明宫得健凝胶剂药效长。治疗试验中,I组羊只给予生理盐水,但山羊在治疗的中期也表现出各项生理指标归于正常的趋势,这是羊自身免疫机制被激发,自身防御能力的作用。试验中,尽管病羊的各项生理指标都有不同程度的异常,但都是在正常范围上下波动,变化程度并不大。子宫内膜炎的炎性病变只局限于子宫,还未引起类似于菌血症的全身症状,这可能与临床病羊的体况差于人工疾病模型羊有关。硫酸铵、氢氧化钠、冰醋酸、浓氨水、尿液分析试纸条、酶标仪、飞鸽低速台式离心机、5mL一次性真空采血针管(无抗凝剂)、试管、移液枪、计时器、5mL离心管。1.3测试方法1.3.1血样的采集和测定早晨于饲喂前用玻璃试管采集新鲜尿液,放入冰盒保存待检。尿液采集完成后,使用5mL真空采血管于颈静脉采集血样,立即放入冰盒内,室温静置30min,3500r/min离心20min,收集血清保存在-20℃待测。于机器挤奶前采集新鲜乳样,盛放于5mL离心管中,放入冰盒保存待检。1.3.2颗粒、颗粒、颗粒、颗粒的制备将亚硝基铁氰化钠3g,无水碳酸钠50g,硫酸铵100g,研细、混匀备用。操作步骤如下,用药勺移取少许粉剂于载玻片上,再用滴管吸取新鲜的尿样、乳样或血清2~3滴滴于粉剂上,约3min后判读结果。无颜色变化为阴性,颜色变粉红色以上者即为阳性。1.3.3亚硝基铁氰化钠/、碱法配制5%亚硝基铁氰化钠溶液,10%氢氧化钠水溶液,20%醋酸(98%醋酸20mL,加蒸馏水至98mL)。按如下操作步骤进行,取试管一支,先加新鲜尿液或乳液5mL,随即加入5%亚硝基铁氰化钠水溶液和10%的氢氧化钠水溶液各0.5mL(约10滴),颠倒混合,再加20%醋酸1mL(约20滴),再颠倒混合,观察结果。无颜色变化为阴性,颜色变浅红色以上者即为阳性。1.3.4a、c试剂的制备取硫酸铵100g及亚硝基铁氰化钠1g配制成A试剂,28%浓氨水制成B试剂。按如下操作步骤进行,取被检样品5mL,加A试剂1g,振荡溶解,沿管壁加B试剂1mL,重积其上,静置,观察结果。若在两液面交界处出现淡红色环轮即为阳性。1.3.5试纸条上的边缘清除试纸条上的处理单元用手拿纸末端的塑料部分,将试纸条测试区浸入尿样中,30s后取出,在容器的边缘将试纸条上多余的尿液清除掉,将试纸条测试区与瓶子标签上的比色区相对照。本方法以比色区粉色血清BHBA浓度为1.47mmol/L(150mg/L)为判断标准,颜色在粉色以上者,即血清BHBA浓度大于此值为阳性。1.3.6测试盒测试β-羟丁酸的定量检测合格按说明书操作进行,β-羟丁酸含量大于1.2mmol/L则判为阳性。1.4数据的分析和计算统计各种方法检测的结果,并以β-羟丁酸定量检测的结果为标准,计算其他各种方法测得结果的阳性率、符合率、敏感性和特异性。2结果与分析2.1牛、肉的诊断结果本试验中每种试验方法测得样品总数均为96个,以试剂盒测得血清β-羟丁酸含量大于1.2mmol/L作为亚临床酮病奶牛的诊断标准,β-羟丁酸测得的阳性率为28.13%,测定结果见表1。其中酮粉法测尿酮检出阳性率最高,为25.00%;酮粉法测血酮次之,为23.96%;ROSS法测尿酮的阳性率最低,仅为13.54%。从准确度来看,酮粉法测血酮的符合率最高,为88.54%;试纸法测尿酮次之,为87.50%;ROSS法测尿酮的符合率最低,仅为79.17%。2.2其他检测方法的敏感性和特异性以血清β-羟丁酸浓度大于1.2mmol/L作为亚临床酮病的诊断标准,β-羟丁酸试剂盒测得的阳性数为27,分析其他4种检测方法的敏感性和特异性,结果见表2。酮粉法测血酮的特异性为94.20%,较试剂法测乳酮、ROSS法测尿酮和试纸法测尿酮低,但其敏感性最高,为70.37%;ROSS法测尿酮的敏感性最低,为37.04%;酮粉法测尿酮特异性最低,为88.41%。这些结果可能与检测样品数、试剂的稳定性及操作过程有关。3酮体的定性检测奶牛亚临床酮病的临床诊断较为困难,寻找快速、准确、实用的早期诊断方法一直是研究奶牛酮病的热点。目前定性检测奶牛酮病方法很多,主要有酮粉法、试剂法、ROSS法和试纸法等。酮体包括乙酰乙酸(20%)、β-羟丁酸(78%)、丙酮(2%)。正常奶牛体内的酮体含量不多,少量的酮体可以在肝脏被代谢掉,发生亚临床酮病时,奶牛血液中各种酮体含量都会升高,并且乳汁和尿液中的酮体含量也会升高,因此可以通过定性检测尿液、乳汁中的酮体含量来诊断酮病。目前酮体的定性检测主要是采用亚硝基铁氰化钠进行颜色反应,它只对乙酰乙酸敏感,与丙酮的反应较差,与β-羟丁酸几乎不发生反应。而与β-羟丁酸相比,乙酰乙酸的浓度较低,这样就使得到的结果误差较大,有研究表明,酮症酸中毒越严重,酮体中β-羟丁酸所占的比例越大,乙酰乙酸所占的比例越小,这时就会造成阳性结果偏低。血样、乳样以及尿样都带有一定程度的颜色,如果颜色变化程度较小,肉眼可能看不出来;另外,各种方法的敏感性也不一样,当样品中酮体的浓度比较低时,难以发现颜色变化。乳酮、尿酮与血酮具有一定的相关性,但是乳酮、尿酮都不能绝对地代表血酮水平,由于个体差异、品种的差异以及环境的差异乳酮、尿酮与血酮的相关程度也不一样,无论用什么方法测定尿酮和乳酮,结果都会有一点偏差。酮粉法定性检测酮体虽具有方便、快捷等优点,但其试剂在潮湿和高温环境下易分解生成褐色化合物,对测定结果产生较大影响,必须保存在干燥的棕色玻璃瓶中。尿酮的检测之所以阳性率高,是因为酮体的肾阈比较低,所以在发生酮血症之前,通常就已经发现尿酮含量的升高,本试验结果尿酮测定阳性率比乳酮测定阳性率高,这与某些学者的研究结果相同,但也有学者报道乳酮含量比血酮和尿酮还高。有研究表明,尿酮和乳酮的平均值与血酮值呈高度正相关。从试验成本来看,酮粉法测乳酮和尿酮成本最低;从操作难易度上来比较,酮粉法测乳酮、尿酮和试纸法测尿酮均比较简单,操作最复杂的是酮粉法测血酮;从样品的采集难易度来看,乳样的采集