苏云金芽孢杆菌发酵清液工艺条件优化研究

苏云金芽孢杆菌发酵清液工艺条件优化研究

氨基乙醇菌是国内外最常见的寄生虫。它主要用于预防和处理农业、牧场和其他领域的害虫。随着人们对绿色食品的日益青睐,它的应用范围越来越广,据报道采用苏云金芽孢杆菌杀虫剂与磷化铝混配防治酒曲害虫,杀虫的效果比单一用磷化铝效果好。它的主要杀虫活性成分是伴孢晶体蛋白,是在菌体形成芽孢的同时形成的,正常情况下一个菌体可产生一个伴孢晶体蛋白。因此,如何充分利用企业中现有的设备和条件,延长对数期增加菌体量是提高产品产量和品质的关键点。现行的生产方法主要是分批液体发酵法生产,对Bt不断深入的研究和生产水平不断的提高,分批发酵法生产水平逐渐达到了极限,本实验通过对培养基及发酵工艺的改进在保持单位效价不变,降低非有效组份的含量以提高产品和品质。1材料和方法1.1苏云金蘑菇1.2基本培训1.3实验设备1.4发酵剂发酵实验1.4.1发酵培养基优化实验通过预试验、单因子试验,确定葡萄糖、蛋白胨、酵母水溶性浸出物3个因子,葡萄糖、蛋白胨取6个水平,酵母水溶性浸出物取4个水平,进行发酵,研究Bt生产的适宜培养配方(见表1)。摇瓶培养发酵,在培养24h和38h取样涂片观察生理形态、测量酸碱度和湿菌重。得适宜培养基的配方为:4%葡萄糖,4%蛋白胨,2.5%酵母水溶性浸出物,0.5%无机盐。1.4.2工艺条件改进实验1.4.2.1溶解氧最低控制量的实验发酵周期中使用恒搅拌转速培养,在对数中后期溶解氧有两三个小时的时间处于极低状态,此时分别通过调节搅拌速度使溶解氧最低值控制在1.5%、3.0%、4.5%三个浓度水平,18h取样测菌体湿重,34h取样测定生物效价和晶体含量。1.4.2.2培养温度影响实验方案A控制培养温度27℃,恒温培养;方案B控制培养温度30℃,恒温培养;方案C控制培养1-20h温度30℃,20h后33℃培养,从8h至26h每两个小时取样测量菌体湿重,并观察伴孢晶体80%脱落时结束培养,取样检测生物效价和晶体含量并计培养周期。比较各方案的差异。1.4.2.3补料发酵实验配10L培养基,含4%葡萄糖,4%蛋白胨,2.5%酵母水溶性浸出物,0.5%无机盐混合液在微型全自动发酵罐中120℃实罐来灭菌30min,30℃恒温培养,控制搅拌转速使溶解氧水平不低于3.0%。在13h时补加2%和4%的葡萄糖液,测量24h时的菌体湿重,在伴孢晶体80%脱落时结束培养,取样检测生物效价、还原糖和晶体含量。比较其差异。1.4.3发酵罐发酵实验配10L培养基,含4%葡萄糖,4%蛋白胨,2.5%酵母水溶性浸出物,0.5%无机盐混合液在微型全自动发酵罐中120℃实罐来灭菌30min,按一定接种量将种子接入培养基中,在一定的温度下进行培养,300r/min,培养时间35h。1.4.4pH的测定1.4.5生理形态观察方法:1600倍光学显微镜观察1.4.7伴孢晶体含量测定2.1不同发酵时间条件下溶解氧的变化本试验在发酵过程设计了3个溶解氧的最低浓度水平,18h取样测菌体湿重,34h取样测定生物效价和晶体含量。试验结果列于表2和图1。比较在这3个浓度下发酵生长的菌体湿重和晶体重,发现发酵。过程控制溶解氧不低于3.0%,此时对整个发酵过程动力能耗最低。因溶解氧的水平对杀虫效果有高达13%的影响,过低造成菌体生长不良,菌体及晶体含量偏少,而过高造成能耗过大。从溶解氧曲线可知:如在发酵周期中使用恒速搅拌培养,在对数生长前期溶解氧水平较高,而进入中后期有两三个小时的时间溶解氧处于极低状态。因此,可采取在发酵过程中使用变速搅拌法进行培养,在对数前期用较低的搅拌转速进行搅拌,进入到对数中后期溶解氧处于极低状态时,采用大幅度提升搅拌转速以增加发酵液中的溶解氧,然后再降低搅拌转速。不同的发酵罐只需要几次实验就可测得最佳实际搅拌转速。2.2发酵温度对发酵的影响本试验采用了3个方案进行发酵培养,试验结果如表3、表4、图2。从表3和表4发现方案C在菌体培养时间18h时,菌体湿重达到最高点,培养周期最短。(图3)这是因为菌体的生长与培养温度成正比,温度高生长快,温度低生长慢,而发酵后期是形成芽孢阶段,提高温度有利于晶体的形成。不适宜的培养温度不但使培养周期大大增长,因其太慢的菌量增值速度对后期的伴孢晶体的合成也产生了很大的影响,在中后期提升培养温度可以缩短培养周期搞高设备周转率。故选择培养1～20h时培养为温度30℃,20h后培养温度为33℃作为最佳培养温度。2.3补加2%葡萄糖液对发酵周期的影响本试验采用优化后的培养基进行培养,在13h时采用了两种浓度进行补料发酵,试验结果表5。从试验过程得到的结果是:补加2%葡萄糖液对生物效价和晶体含量都有比较大的提高,且在培养过程中没有发生反馈抑制现象,补加4%葡萄糖液使发酵周期增加了4h,在对数中后期pH回升困难,发酵结束后残余还原糖也比较高,可能是因为产生一定的抑制作用,生物效价与晶体含量均无明显提高。故以补糖量控制在2%为最佳量。2.41补加2%葡萄糖选用优化后的培养基配方,接种量为1%,发酵29h,培养对数中期补加2%葡萄糖。培养条件:1～20h温度30℃,20h后33℃培养;溶解氧大于3%,使发酵液生物效价达到5200IU/uL的水平,发酵液外观粘度比常规法生产的发酵液要好很多,表观性更好。3糖酸发酵3%氧合物对于提高苏云金杆菌的产量可以通过改进发酵条件来获得。经本试验研究,确定了发酵最佳条件:溶解氧大于3%,培养温度:1～20h为30℃,20h后33℃培养;发酵中期补加2%的糖量,发酵29h。在此条件下,进行发酵可使发酵液生物效价达到5200IU/uL的水平,制得干粉生物效