防治根孢的丝核菌的分离鉴定

防治根孢的丝核菌的分离鉴定

大自然广泛存在于土壤和不同类型的寄生虫中。没有没有性菌，通常以细菌和细菌的形式栖息在土壤中。根据营养菌丝隔膜的结构,丝核菌可分为子囊丝核菌和担子丝核菌。担子丝核菌根据细胞核数目多少又分为多核丝核菌和双核丝核菌。在担子丝核菌中最有用的分类依据是菌丝融合群(AG)。双核丝核菌可从植物的根部和茎部分离到,包括无致病性和弱致病性双核丝核菌。已确定的双核丝核菌有23群,这23群在培养性状和致病性上都有区别。自White等1990年首先设计ITS引物对真菌核内核糖体RNA基因进行扩增以来,ITS序列分析技术在真菌分类、鉴定的研究中应用越来越广泛。菌丝融合群分类法是双核丝核菌最重要的分类手段,随着分子生物学及相关学科的迅速发展,将菌丝融合群与分子生物学手段结合起来进行研究已是丝核菌研究的主流。本文通过融合反应和ITS区段的克隆及序列分析,准确快速的鉴定分离菌株的归属。1材料和方法1.1丝绸细菌的分离和提取分离方法采用常规组织分离法。1.2核酸丝核菌的鉴定分离菌株经HCl-Giema染色后,镜检其菌丝形态和细胞核数目,对分离物进行初步鉴定,鉴定出的双核丝核菌参考陈延熙等人改进的玻片配对法。在显微镜下观察2个不同菌株菌丝是否有相互融合,并测定菌丝直径。1.3发酵温度及分级标准供试菌株有Gx-YT-06-3、dh-YT-06-17、chd-YT-3。将供试菌株在无菌条件下接种到2%的水琼脂培养皿的平板中央,在25℃下培养2d。同时将供试作物的种子用70%酒精消毒30s,0.1%升汞消毒3min,用灭菌水反复清洗3次,放置于已灭过菌的培养皿中的滤纸上,加适量的灭菌水,在25～28℃条件下放置于恒温箱里催芽至露白。根据实验目的,按每一菌株为一处理,每一处理3个重复,并设置1个对照。将已露白的种子在无菌条件下接种于培养好的有菌水琼脂培养皿上,每皿10粒种子。按白天12h温度为28～30℃,夜晚12h温度16℃的条件放置于人工气候箱中生长7d后,按0～4级划分分级标准为:0=无症状;1=中胚轴上有少数的褐色或黑色病斑;2=中胚轴的褐色病斑<50%;3=中胚轴的褐色病斑>50%;4=幼苗全部死亡,观察记录实验结果。1.45.pcr扩增与纯化将分离菌株的菌丝接种于于液体PDA中,培养出的菌丝用液氮充分研磨至粉末状,采用CTAB法提取DNA。ITS扩增引物为ITS1和ITS4。扩增反应在PCR仪PerkinElmer上进行,PCR反应体系为50μl。如下PCR循环:94℃预变性3min,循环1次;94℃变性1min,51℃退火1min,72℃延伸1min,30次循环;最后72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物用大连宝生物提供的试剂盒进行纯化。dh-YT-06-17用纯化产物进行直接测序。Gx-YT-06-3和chd-YT-3的PCR纯化产物与载体pGEM-T-easy连接反应、转化,经红-白斑筛选后进行重组质粒PCR,最后选取阳性重组子送上海生工进行测序。2结果与分析2.1气生病原菌培养分离菌株的菌丝体初期为灰白色,随着培养时间的延长,菌丝颜色变深,产生一定量的气生菌丝,分离菌株培养见图1。分离菌株菌丝直径平均为2.76μm,各个分离菌株之间没有明显的区别。2.2桶孔隔膜的发育所分离到的菌株,均具有立枯丝核菌的形态特征。即有明显的桶孔隔膜,分枝一般呈直角,分枝发生点附近缢缩并形成一隔膜,菌丝呈各种深浅不同的褐色,菌丝中细胞为双核。经融合反应鉴定,所分离到的丝核菌均为双核丝核菌AG-R。2.3分离菌株的致病性Gx-YT-06-3、dh-YT-06-17、chd-YT-3菌株对白菜幼苗根部、茎基部和茎部都有不同程度的致病力。用分离菌株接种发病率均为100%,菌株chd-YT-3和dh-YT-06-17的致病性较强。发病症状为:在幼苗的茎部和叶部有褐色斑点,根部变为褐色,chd-YT-3和dh-YT-06-17接种的白菜苗几乎全部死亡。空白对照的白菜未发病(图2)。2.4dh-yt-3的同源性分析分离菌株Gx-YT-06-3、dh-YT-06-17、chd-YT-3均能扩增到大约700bp的片段。Gx-YT-06-3和chd-YT-3质粒PCR结果见图3。从图4中可以看出,分离菌株dh-YT-06-17和chd-YT-3的同源性为100%,与标准菌株AG-R的同源性为98%,Gx-YT-06-3与标准菌株AG-R的同源性为99%,所有分离菌株与从西南桦苗上分离到的菌株的同源性是98%～99%。由此可看出,分离菌株均属于AG-R,与菌丝融合技术得到的结果完全一致。3丝核菌与麻黄的共生关系从德宏、广西、成都芋头中分离到丝核菌,经常规鉴定和分子生物学鉴定得出,该分离菌株属于双核丝核菌AG-R,用分离菌株对白菜苗做致病性测定,对白菜苗均有一定程度上的致病性,但此丝核菌的存在对芋头的生长并没有造成负面影响,植株仍然健康生长。丝核菌和芋头是否存在共生关系还有待进一步验证。从采来的芋头球根中均能分离到丝核菌,分离到丝核菌的频率很高,