版中国药典微生物限度检查方法验证方案名师资料合集(完整版)资料

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版中国药典微生物限度检查方法验证方案名师资料合集（完整版）资料(可以直接使用，可编辑优秀版资料，欢迎下载）人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC组签名：日期：审核部门：QC组签名：日期：部门：质量部签名：日期：批准质量负责人签名：日期：质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门：01质量部下表用于记录修订/变更主要内容及历史。文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00按GMP（2021年修订版）要求新制定

目录1.概述2.验证目的和范围3.组织及职责4.验证进度计划表5.验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6.验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审

1.概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2021版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。2.验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。3.组织及职责3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。3.2验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。3.3验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。3.4验证工作小组成员表姓名部门及职务职责黄汉新质量负责人/质量受权人负责验证方案及报告的批准胡建新质量部QA组长审核验证方案、审核验证报告并协调工作曾凤敏质量部QC组长负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工作刘红华质量部QC负责验证方案起草、具体实施、报告工作4.验证进度计划表本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2021年12月至2021年1月。5.验证所需要的仪器设备及相关文件的确认序号仪器设备名称型号编号校准单位校准日期有效期至1电子天平2生化培养箱3生化培养箱4生化培养箱5立式压力蒸汽灭菌锅6生物洁净安全柜检查人/日期：复核人/日期：文件名称文件编码是否有效版本文件保存处《人工牛黄甲硝唑胶囊内控质量标准》□是□否质量部《人工牛黄甲硝唑胶囊检验操作规程》□是□否质量部《取样操作规程》□是□否质量部《微生物限度检查操作规程》□是□否质量部《微生物实验室清洁消毒操作规程》□是□否质量部《培养基的管理制度》□是□否质量部《检定菌的保存、传代、使用、销毁规程》□是□否质量部《LDZX-30FBS立式压力压蒸汽灭菌器操作规程》□是□否质量部《SPX-150B生化培养箱操作规程》□是□否质量部《BHC-1300IIA/B3生物洁净安全柜操作规程》□是□否质量部《JJ200电子天平操作规程》□是□否质量部检查人/日期：复核人/日期：6.验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认6.1.试验菌种检查表金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003铜绿假单胞菌CMCC（B）10104枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501白色念珠菌CMCC（F）98001黑曲霉CMCC（F）98003大肠埃希菌CMCC（B）44102乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094检查人/日期：复核人/日期：6.2试验所需的培养基检查序号名称生产厂家是否通过培养基适用性试验批号01胰酪大豆胨液体培养基北京三药科技开发公司□是□否02胰酪大豆胨琼脂培养基北京三药科技开发公司□是□否03沙氏葡萄糖液体培养基北京三药科技开发公司□是□否04沙氏葡萄糖琼脂培养基北京三药科技开发公司□是□否05麦康凯液体培养基北京三药科技开发公司□是□否06麦康凯琼脂培养基北京三药科技开发公司□是□否07RV沙门菌增菌液体培养基北京三药科技开发公司□是□否08木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基北京三药科技开发公司□是□否09三糖铁琼脂培养基北京三药科技开发公司□是□否检查人/日期：复核人/日期：

6.3.检验样品确认表序号品名生产厂家批号规格是否按GMP要求生产1人工牛黄甲硝唑胶囊佛山市华普生药业甲硝唑0.2g人工牛黄5mg□是□否2人工牛黄甲硝唑胶囊佛山市华普生药业甲硝唑0.2g人工牛黄5mg□是□否3人工牛黄甲硝唑胶囊佛山市华普生药业甲硝唑0.2g人工牛黄5mg□是□否检查人/日期：复核人/日期：7.验证项目和验证方法7.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20～25℃培养5～7天，直到获得丰富的孢子。加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/m的孢子悬液备用。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃,在验证过的贮存期内使用。验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。7.3.需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法.供试液的制备取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液。.试验组取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养5天，点计菌落数。另取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。常规倾注平皿法方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0.5〜2范围内。常规倾注平皿法方法验证的结果常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验菌株菌种代数试验组供试品对照组菌液对照组试验菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。7.4.需氧菌总数检查—离心沉淀-薄膜过滤法7.4.1.供试液的制备取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液贮备液。取1:10的供试液贮备液50ml，经500转/分钟离心3分钟，取上清液得供试液。7.4.2.试验组取供试液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。7.4.3.供试品对照组取供试液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次），平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养5天，点计菌落数。7.4.4.菌液对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，200ml通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，在余下的100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。稀释剂对照组依照7.2项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，然后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下面的试验。取上层菌液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次），每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0.5〜2范围内，同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0.5〜2范围内。.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天

试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天

试验人/日期：复核人/日期：7.4.8.离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验，若试验组各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，稀释剂对照组各试验菌株的的回收率也在0.5～2范围内，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总数检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数。7.5.控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法若在7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法的试验中，证实了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性，不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查，则为了确保控制菌检查的可靠性，采用可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进行控制菌检查，按照以下方案进行方法学验证。7.5.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌，所以选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。7.5.2控制菌检查方法验证的菌液制备分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。大肠埃希菌检查方法验证供试液的制备取供试品10g，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液贮备液。取1:10的供试液贮备液50ml，经500转/分钟离心4分钟，取上清液得供试液。取供试液10ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入～100cfu的大肠埃希菌，过滤。取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42～44℃培养24～48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。组～100cfu/ml，然后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下面的试验。取上层菌液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次）。取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中,42～44℃培养24～48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。阴性对照应无菌生长。

试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号（菌种编号）过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号麦康凯液体培养基配制批号麦康凯琼脂培养基平板配制批号培养箱型号编号温度℃型号编号温度℃型号编号温度℃培养时间开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时试验组阳性对照组阴性对照组试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号（菌种编号）过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号麦康凯液体培养基配制批号麦康凯琼脂培养基平板配制批号培养箱型号编号温度℃型号编号温度℃型号编号温度℃培养时间开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时试验组阳性对照组阴性对照组试验人/日期：复核人/日期：

试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号（菌种编号）过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号麦康凯液体培养基配制批号麦康凯琼脂培养基平板配制批号培养箱型号编号温度℃型号编号温度℃型号编号温度℃培养时间开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时开始月日时结束月日时试验组阳性对照组阴性对照组试验人/日期：复核人/日期：大肠埃希菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验，若试验组与阳性对照组均检出典型大肠埃希菌，阴性对照组无菌生长，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的大肠埃希菌检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进行检查。菌检查方法验证7.5.4.1供试液的制备取样品10g加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml制成1:10的供试液。取全部供试液经500转/分钟离心4分钟，取全部上清液为供试液。.2.试验组取全部供试液，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次（100ml/次）。然后在第3次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入～100cfu的乙型副伤寒沙门菌，过滤。取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基,30～35℃培养18～24小时。取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时。7.5.4.3阳性对照组～100cfu/ml，然后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下面的试验。取上层菌液1ml，加至100ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次）。取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基,30～35℃培养18～24小时。取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时。.4阴性对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，全量通过薄膜（孔径0.45μm混合纤维素膜）后，取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。阴性对照应无菌生长。7.5.4.5离心沉淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果

试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号（菌种编号）过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号RV沙门增菌液体培养基配制批号木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板配制批号三糖铁琼脂培养基斜面和高层穿刺接种配制批号培养箱型号编号温度℃型号编号温度℃型号编号温度℃型号编号温度℃培养时间月日时至月日时月日时至月日时月日时至月日时月日时至月日时试验组阳性对照组阴性对照组试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号（菌种编号）过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号RV沙门增菌液体培养基配制批号木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板配制批号三糖铁琼脂培养基斜面和高层穿刺接种配制批号培养箱型号编号温度℃型号编号温度℃型号编号温度℃型号编号温度℃培养时间月日时至月日时月日时至月日时月日时至月日时月日时至月日时试验组阳性对照组阴性对照组试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号（菌种编号）过程增菌培养选择培养分离培养结果判断培养基胰酪大豆胨液体培养基配制批号RV沙门增菌液体培养基配制批号木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板配制批号三糖铁琼脂培养基斜面和高层穿刺接种配制批号培养箱型号编号温度℃型号编号温度℃型号编号温度℃型号编号温度℃培养时间月日时至月日时月日时至月日时月日时至月日时月日时至月日时试验组阳性对照组阴性对照组试验人/日期：复核人/日期：7.5.4.6乙型副伤寒沙门菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验，若试验组与阳性对照组均检出典型乙型副伤寒沙门菌，阴性对照组无菌生长，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的乙型副伤寒沙门菌检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及乙型副伤寒沙门菌检查方法进行检查。8.偏差与漏项控制：微生物限度检查方法验证过程中存在和发现的任何偏差与漏项，都应进行详细的记录，并应按公司GMP文件《偏差处理规程》进行调查与处理。偏差调查与处理的报告和支持文件，应作为此确认方案的附录部分。偏差和漏项记录表偏差和漏项：处理过程：检查人/日期：复核人/日期：

9.验证报告会审验证报告会审表验证项目名称人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证验证项目负责人黄汉新验证起止日期验证报告编号R-TS-VP-4201-00验证结论：评价和建议：验证报告会审人签名起草部门：质量部QC组签名/日期：审核部门：质量部QC组签名/日期：部门：质量部QA组签名/日期：批准质量负责人签名/日期：《药品微生物检测技术》自测试题适用班级：生物制药技术101-102班题号一二三四五六总分得分一、名词解释（15分，每小题3分）1、分离的含义2、菌落的概念3、无菌操作的概念4、无菌技术5、放线菌二、选择题（30分，每小题2分）1、平板划线分离的方法有A．斜线法B.圆圈法C.直线法D.纸片法2、直接计数法的缺点A.难算B.容易出错C.不能区分细菌死活D.速度慢3、数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少个/mlA.1350B.2280C.2238D.28804、配制培养基有哪几个步骤A.9B.10C.8D.75.病毒大小的测量单位是A.纳米B.微米C.毫米D.厘米6、病毒的种类不包括A.植物病毒B.昆虫病毒C.致病病毒D.噬菌体7、人们使绿脓杆菌噬菌体能有效控制绿脓杆菌的感染，绿脓杆菌噬菌体是A.细菌B.植物病毒C.动物病毒D.细菌病毒8、原核细胞型微生物和真核细胞型微生物的不同主要是A.单细胞B.原始核，细胞器不完善C.在人工培养基能上生长D.有细胞壁E.对抗生素敏感9、G－菌相比，G＋菌细胞壁的特点是A.较疏松B.无磷壁酸C.有脂多糖D.有脂蛋白E.肽聚糖含量多10、抵抗力最强的细菌结构是A.芽胞B.外膜C.鞭毛D.核糖体E.细胞壁11、单个细菌在固体培养基上生长可形成A.菌丝B.菌团C.菌苔D.菌落E.菌膜12、大多数病原菌生长最适的PH值为13、下列细菌中繁殖速度最慢的是A.大肠杆菌B.链球菌C.脑膜炎球菌D.结核杆菌E.变形杆菌14、最常用、最有效的灭菌方法是：A.干烤B.焚烧C.高压蒸汽灭菌D.紫外线杀菌E.过滤除菌15、关于湿热灭菌法，不正确的是：A.是最常用的灭菌法B.在相同温度下，湿热杀菌效果比干热好C.在湿热状态下，菌体可吸收水分使蛋白质易于凝固D.湿热比干热的穿透力弱E.蒸汽有潜热存在三、填空题（20分，每空1分）1、革兰氏阳性菌的细胞壁是由和组成的。2、菌种在培养或保藏过程中，由于的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。3、直接计数法分四种，分为、、、。4、培养基按用途分为、、、5、酵母菌的繁殖方式为和。6、病毒的复制周期主要包括、、、四个连续步骤。7、细菌经革兰染色后，被染成紫色的是菌，被染成红色的是菌。8细菌繁殖的方式是四、判断题（10分，每小题1分）1、革兰氏阳性菌有外膜。2、革兰氏阴性菌的厚度比阳性菌的厚度厚3、细胞壁的基本骨架是肽聚糖4、自然界中，微生物都是以一个个的方式存在的5、可以用固体培养基分离来取得纯培养6、利用固体培养基分离，在平板上，单个的菌落一定是纯培养7、某些好氧菌会在琼脂中间缺氧影响生长8、当采集无菌样品时，一条最重要的规则是：千万别污染样品。9、细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成反比10、菌落总数有时也称为杂菌数五、简答题（10分，每小题5分）1、磷壁酸的功能2、利用固体培养基分离的原理六、设计题/综合题（15分）革兰氏染色的步骤七、附加题（20分）稀释倾注平板法的做法实验室病原微生物危害评估报告第1版生效日期：2021年08月02日XX市疾病预防控制中心综合实验室目录第一章综合实验室实验活动生物危害评估报告 1第二章结核分枝杆菌的生物危害评估报告 7第三章金黄色葡萄球菌的生物危害评估报告 12第四章副溶血性弧菌的生物危害评估报告 15第五章致泻大肠埃希菌的生物危害评估报告 17第六章伤寒沙门氏菌的生物危害评估报告 19第七章志贺氏菌的生物危害评估报告 22第八章蜡样芽胞杆菌的生物危害评估报告 24第九章单核增生李斯特菌的危害评估报告 28第十章流感病毒的危害评估报告 31第十一章禽流感病毒的危害评估报告 33第十二章肠道病毒71型的危害评估报告 36第十三章麻疹病毒的生物危害评估报告 39第十四章人类免疫缺陷病毒HIV的生物危害评估报告 41第十五章乙型脑炎病毒的生物危害评估报告 43第一章综合实验室实验活动生物危害评估报告为保证实验室工作人员在工作中不被危害性生物及物品所侵害，保证危害性物品不外泄，对实验室工作环境进行评估，以鉴定生物安全防护等级，保证生物安全。一、危害程度分类及生物安全防护水平评估生物源危害主要是由各种检验标本中的微生物，尤其是病原微生物引起的，包括细菌、病毒、寄生虫等，具有潜在危险性，可能引起实验室感染；微生物室还进行一定数量的各种条件致病性细菌及真菌的分离培养工作，工作过程存在病原微生物对实验人员、环境污染的风险；除之以外实验室还存在触电、火灾、化学品腐蚀、偷盗等危险。根据《实验室生物安全通用要求》，本实验室不涉及《人间传染的病原微生物名录》中高致病性微生物的分离培养及高致病性微生物的菌、毒种的保藏，实验室采用一定防护措施就能控制感染或防范灾害，或者对相应病原体存在有效的免疫方法。评估我实验室生物安全防护水平按二级实验室（BSL-2）生物安全要求。二、实验人员和实验室安全防护的一般要求1.吸烟危害评估及防护（1）实验室工作区内绝对禁止吸烟；（2）点燃的香烟是易燃液体的潜在火种；（3）香烟、雪茄或烟斗都是传染细菌和接触毒物的途径。2.实验区内食用食物、饮料及其它危害评估及防护（1）实验工作区内不得有食物、饮料及存在“手－口”接触可能的其它物质（2）实验室工作区内的冰箱禁止存放食物。专用存放食物的冰箱应放置在允许进食、喝水的休息区内。3.使用化妆品危害评估及防护实验工作区内禁止使用化妆品进行化妆，但允许并建议经常洗手的实验人员使用护手霜。4.实验中眼睛和面部的风险评估及防护（1）处理腐蚀性或毒性物质时，须使用安全镜、面罩或其它保护眼睛和面部的防护用品。（2）工作人员在实验室的危险区内不要佩戴隐形眼镜，除非同时使用护目镜或面罩。（3）使用、处理能够通过粘膜和皮肤感染的试剂，或有可能发生试剂溅溢的情况时，必须佩带护目镜、面罩或面具式呼吸器。5.实验中服装和个人防护装备的一般要求（1）应穿着符合实验室工作需要的服装，工作服应干净、整洁。当工作中有危险物喷溅到身上的可能时，应使用一次性塑料围裙或防渗外罩。有时还需要佩戴其它防护装备如：手套、护目镜、披肩或面罩等。（2）采血员和其他需要接触病员的工作人员，在接触病员时需穿实验服或工作服。（3）个人防护服装应定期更换以保持清洁，遇被危险物品严重污染，则应立即更换。（4）不得在实验室内设值班床，严禁在实验室内住宿。6.实验中足部防护的一般要求在工作区内，应穿舒适、防滑、并能保护整个脚面的鞋。在有可能发生液体溅溢的工作岗位，可加套一次性防渗漏鞋套。帆布鞋可吸收化学物品和有传染性的液体，所以最好穿皮革或其它防渗漏的合成材料的鞋。7.实验中头发和饰物的风险评估及防护留长发的工作人员应将头发盘在脑后，以防止头发接触到被污染物和避免人体脱屑落入工作区。头发不得垂肩，应与离心机、切片机等正在运转的器械保持一定距离8.实验中胡须的风险评估及防护蓄有胡须的男性工作人员必须遵守上项（7）的规定。9.洗手的要求实验室工作人员在脱下手套后、离开实验室前、接触患者前后、以及在进食或吸烟前都应该洗手。接触血液、体液或其它污染物时，应立即洗手。10.用口移液的危害评估及防护用口液移可导致多种病原体的实验室感染。所有实验室操作禁止用口液移，应使用助吸器具。11.锐利物品的危害评估及防护谨慎处理针头、解剖刀、和碎玻璃等锐利物品。使用后的针具不要折断、弯曲、破损、重复使用或用手重装在针管上。一次性注射器上的针头用后不要取下。锐利物品应立即放置在专用锐器盒内，在完全装满之前或48小时之内更换。12.隔离措施的要求接触患者时，实验室工作人员应遵守医院的隔离措施。13.工作环境的要求（1）“清洁”区和“非清洁”区根据实验室的具体工作情况由主任选择并确定“清洁”和“非清洁”工作区，在清洁区和非清洁区之间设“缓冲室”。被指定为“清洁”的区域，则应努力保持清洁，如采取预防措施，防止、视频显示器终端、键盘、门柄及其它经常被手或手上的手套触摸的物品的污染，要求工作人员在触摸设备（如计算机键盘及的保护罩等）前取下手套，制定仪器设备和工作面的常规消毒和清洁制度和对严重污染的紧急处理措施办法。被指定为“非清洁”的区域，允许戴手套接触所有物品（如、门柄、计算机终端和其它物品），所有这些物品的表面都认为是不清洁的。未戴手套的人员如果使用该区域内的、计算机终端或其它设备，应该戴上手套，或在使用后立即彻底洗手。“清洁”和“非清洁”区都应保持整洁。实验台至少应每天清洁、消毒一次，如有必要可以多次清洗、消毒。在处理溅溢的样品或严重污染的工作面时，应戴上手套和其它个人防护装备、使用相应合适的清洁剂清除所有的溅溢物。（2）冰箱、冷冻柜、水浴和离心机应该定期清洗和消毒（时间由实验室主任来决定），在发生严重污染后应立即进行清洗和消毒。进行清洗、消毒时要戴上手套，穿上工作服或其它合适的防护服。（3）外衣：外衣（实验服、工作服、和围裙）应悬挂在远离散热器、蒸汽管道、供暖装置、以及有明火的地方，不要挂在压缩气瓶或灭火器上，也不要挂在门的玻璃隔板上，妨碍视线。“清洁”的和“非清洁”的个人防护服要分开存放。（4）垃圾处理：每天至少清理垃圾一次。（5）装饰：不得在电灯、灯座或仪器上进行装饰，更不要使用电子装饰物、蜡烛、圣诞树等有引起火灾危险的装饰品。（6）为便于清洁消毒，实验室内不应有织物装饰的用具或椅子。（7）个人物品：实验工作区不得存放个人物品，如钱包、外套、皮靴、咖啡杯、运动服、预包装的食品和药品等。（8）实验室内应配备应急设备，如应急洗眼装置，酒精等消毒用品。（9）实验室应安装非手触式洗手装置。（10）实验室内应安装防蚊蝇装置，应定期投撒灭蟑螂、老鼠的药物。（11）用后的废弃物品：实验工作区内的用后废弃物品存量不要太大。具危险性的液体如酸或碱性液体应放在视平线以下。较大的废弃物容器应靠近地面存放。（12）出口通路：实验室的出口和通道必须保持畅通无阻，不准堆放物品、垃圾、装置、或设备。安全门必须保持畅通，不得堵塞。注意：无论任何时间、何种原因都不得阻塞通往灭火器、火警箱、防火毯、安全淋浴或出口的道路。14.使用玻璃器具的危害评估及防护操作玻璃器具时应遵循下述安全规则：（1）不使用破裂或有缺口的玻璃器具。（2）不要用猛力取下玻璃试管上的塞子，粘紧的试管可用刀切开分离。（3）接触过传染性物的玻璃器具，清洗之前，应先行消毒。（4）破裂的玻璃器具和玻璃碎片应丢弃在有专门标记的、单独的、不易刺破的容器里。（5）高热操作玻璃器具时应戴隔热手套。（6）在不影响实验质量的前提下，应尽量减少使用玻璃器具。15.使用离心机的危害评估及防护感染途径危害评估感染途径危害评估感染途径危害评估皮肤极少粘膜（眼结膜）可能呼吸道可能消化道（经手-口）极少经血（针刺伤、切割伤）极少经血（虫媒介）极少（1）气溶胶：离心过程中应控制气溶胶的产生在最低水平。（2）操作：离心机只有在盖好盖板后，才能启动。（3）传染性物品：所有能够产生气溶胶进行播散的生物制品或标本，都应使用密封的离心管，并在盖紧的离心头或转头中进行。（4）为防止气溶胶飞溢，应在离心停止30分钟后打开离心物。（5）清洗：按照消毒隔离制度要求清洗离心机。（6）平衡：离心时应保持合适的平衡，以保证离心的顺利进行。16．采集血样的危害评估及防护感染途径危害评估感染途径危害评估感染途径危害评估皮肤极少粘膜（眼结膜）极少呼吸道可能消化道（经手-口）极少经血（针刺伤、切割伤）可能经血（虫媒介）极少盗窃可能化学腐蚀极少放射无（1）每天早晨用500mg/L的”84”消毒液擦拭抽血台面及其它物表，并开紫外灯消毒至少30分钟，并做好记录。（2）工人每天早晨更换消毒液，包括浸泡锐器、止血带的消毒液和手消毒液。（3）工作人员必须穿工作服，戴好口罩、帽子、和手套。（4）使用合格的一次性用品。严禁使用包装破损，超过有效期的一次性用品。（5）严格执行无菌技术操作规程、静脉采血必须一人一针一管一巾一带。微量采血应做到一人一针一管一片，对每位病人操作前洗手或手消毒。（6）无菌物品如棉球需每天更换，开启后使用不得超过24小时。（7）工作人员需对锐器如采血针采取高度预防措施，用过的采血针需浸泡在含有消毒液的厚壁容器中。17.标本(血清、血浆、全血、尿)上检验分析仪检测过程的危害评估及防护感染途径危害评估感染途径危害评估感染途径危害评估皮肤极少粘膜（眼结膜）可能呼吸道可能消化道（经手-口）极少经血（针刺伤、切割伤）极少经血（虫媒介）极少盗窃可能化学腐蚀无放射无（1）为了避免液滴和气溶胶和扩散，实验室仪器加样、加液，清洗等过程应在封闭罩内进行的。（2）实验中使后的比色盘，反应杯等废弃物应当收集在封闭的容器内，集中处置。（3）在每一步完成后应根据操作指南对对仪器进行消毒。血液、体液污染物表时，应立即消毒。（4）工作人员要戴手套进行操作。18.标本(血清、血浆、全血、尿、粪)手工检测过程的危害评估及防护感染途径危害评估感染途径危害评估感染途径危害评估皮肤可能粘膜（眼结膜）可能呼吸道可能消化道（经手-口）可能经血（针刺伤、切割伤）可能经血（虫媒介）极少盗窃可能化学腐蚀可能放射无（1）每天早晨做好实验室的清洁消毒工作。（2）工作人员要戴口罩、手套进行操作。（3）实验中使用的竹签用后要用1000mg/L“84”消毒液浸泡。（4）废弃的标本连同试管、盖帽要用1000mg/L“84”消毒液浸泡，由工人统一清洁后进行无害化处理。（5）实验中使用的吸头、一次性塑料杯用后要用1000mg/L“84”消毒液浸泡。（6）标本污染物表时，应立即消毒。（7）离心时，发生试管破裂或标本溅出，由操作者负责用有效消毒剂对离心机内部进行及时消毒处置。19．微生物分离鉴定药敏试验及基因扩增试验活动的危害评估及防护感染途径危害评估感染途径危害评估感染途径危害评估皮肤可能粘膜（眼结膜）可能呼吸道可能消化道（经手-口）可能经血（针刺伤、切割伤）可能经血（虫媒介）可能盗窃可能化学腐蚀极少放射无（1）每天早晨开紫外灯消毒空气至少30分钟，同时做好各物表、仪器的清洁消毒工作。（2）实验人员要戴手套、帽子进行操作。当估计会出现微生物和危险物溅出时要戴好眼罩或面罩。（3）操作中使用的接种环、镊子等金属物品要在酒精灯火焰上烧灼灭菌。（4）可能产生致病性微生物气溶胶或出现溅出的操作如涂片、接种时，应在生物安全柜内操作，并使用个体防护设备。（5）实验室内的各种标本、菌种、培养基和其它废弃物在运出实验室前必须灭活（高压、浸泡），需运出实验室灭活的物品必须放在专用的密闭容器中。（6）操作过程中发生菌种污染物表时，应马上采取措施进行物表消毒。（7）当发生致病性微生物气溶胶污染时，应马上进行人员疏散，通知负责人到现场进行指导消毒。（8）对菌种的保存应严格遵守菌种保存制度，严禁擅自保存各种国家法定传染病菌株或毒株。（9）实验人员离开实验室前要去除手套，确认无污染或污染已排除，后方可洗手离去。（10）微生物、PCR实验室要设置纱窗、挡鼠板。三、特定实验活动危害评估见以下章节之各种病原体的危害评估四、工作人员素质本实验室共有技术人员10名，其中申请进入BSL-2实验室10名。硕士学位3名，5名曾经从事微生物学实验，5名曾经从事无菌实验室活动经历，10名技术人员学习过生物安全手册并通过定期培训及考核成绩合格，经体检无现患严重疾病，本实验室无其他患传染性疾病的技术人员，健康状态良好。五、评估结论本次评估本实验室共14项可能潜在危险的实验活动，在实验操作实验施过程中在无控制措施情况下可能产生的高危害度2项，中度12项，低度0项；对危害发生的可能性分析，实验危害较大可能发生的有0项，可能发生2项，较少可能发生12项；这些危害造成高度严重后果的2项，后果严重性中度的12项，后果严重性低度的0项。根据拟采取的预防控制措施后依然存在的残留风险为高度0项，中度0项，低度危害12项。评估：XX市疾病预防控制中心综合实验室评估人：XX市疾病预防控制中心生物安全管理委员会审核人：2021年8月02日第二章结核分枝杆菌的生物危害评估报告结核病是由结核分枝杆菌（偶尔可由牛型或非洲型分枝杆菌）引起的一种细菌性疾病。结核病可累及全身各个器官，但以肺结核最为常见。该病具有传染性强，散播面广，不分地域均可发生。结核病可由呼吸道、消化道、皮肤等途径感染，但其主要传播途径是以空气为传播因子的呼吸道传染，而排菌的肺结核病人传染性更大，是传播感染的主要传染源。1.传播途径呼吸道感染（respiratortractinfection）是肺结核的主要传染途径（routesofinfection），飞沬传染（dropletinfection）为最常见的方式。传染源主要是排菌的肺结核患者（尤其是痰涂片阳性未经治疗者）。飞沬核（dropletnuclei）＜10μm时可被吸人呼吸道，健康人可因吸入患者咳嗽、打喷嚏时喷出的带菌飞沫而受感染。2.危害程度分级微生物按其是否致病、致病力强弱、危害人体的严重性、传染性的大小、临近人群的抵抗力、有无免疫制剂和特效治疗药物等综合评价，可分为四个不同的危害等级。结核分枝杆菌属于3级危险。3级危险（对个体具有极大危害，对群体具有较大的危害性）：指有特殊危险的致病菌。感染后症状较重，并可能危及生命，或者缺乏有效的预防方法、发病后不易治疗的微生物。3.实验室感染的原因及预防（一）技术操作可能导致的感染及其预防措施。1.接种：应使用无弹力的铂丝接种环，结核菌接种后接种环火焰灭菌易崩散，酒精灯烧灼时要特别注意。2.混匀：吸管吸吹菌液时不要产生气泡，应沿容器壁排出。3.研磨：最好使用组织研磨器，乳钵易产生气溶胶。4.移液：吸管上端的棉花松紧要适度，吸液时要从管底吸取，吹出时要轻缓，不要全部吹净，以免产生气泡，形成气溶胶。5.开封：要避免压力和气流的急剧变化。6.离心：离心管套底垫要完好，使用匹配的管、套、离心头，加盖。7.注射：做好个人防护，正确使用注射器。8.搬运：室内移动要避免滑落，移出室外要有坚实密闭的外包装。（二）技术保障1.双人原则，不允许单人操作1、2类病原。2.入口处应有危险警示标识，并标明所操作的微生物的种类。3.培训考核上岗，掌握相关技术操作要领，熟悉规章制度，适应工作环境。4.完备的管理措施，技术操作规范。5.良好的工作行为可降低生物危害风险。4.实验室中的分枝杆菌及分枝杆菌气溶胶结核病实验室工作人员，在分枝杆菌检验过程中，会接触到各种潜在感染源标本和各种危险物，特别是许多操作易产生分枝杆菌气溶胶。含有结核分枝杆菌的微滴核（1-5微米）通过呼吸进入人体肺泡，可以黏附在肺泡内生长繁殖。因此，首先要对实验室中生物危险物产生的途径和存在的地点有充分的认识，以便明确生物安全防护的环节。(一)分枝杆菌存在的地点1、各种临床标本，通常是痰，胃或支气管灌洗液、脑脊液、尿液等。2、被污染的操作台、器械、仪器、试剂等。3、收集的结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌菌株等。4、细菌学实验室的部分区域。(二)产生分枝杆菌气溶胶1、实验室内可疑肺结核患者痰标本的采集。2、样本的制备和涂片的火焰固定。3、分离培养或接种培养物。4、用火焰烧灼接种环。5、使用移液器混合培养物。6、培养管或培养瓶中含有培养物的滴落物。7、溢出的分枝杆菌悬浮液。8、高速混合含有分枝杆菌的液体。9、转移液态培养物和上清液，或培养液、上清液的倾倒。10、离心过程中离心管的破碎。11、用做原代培养所需的组织匀浆。5.安全防护(一)严格遵守实验室安全操作规程，任何时侯都要警惕分枝杆菌气溶胶的产生。实验室的技术人员必须经过生物安全培训后方可上岗。(二)实验室应严格限制非实验人员进入，减少实验室内外交叉生物污染。完成实验工作离开实验室，要关好门窗。(三)进入实验室应避免携带非必需物品。(四)进入实验室，工作人员应穿着工作服，操作时应穿戴防护隔离衣、口罩、帽子和手套，长发者应将头发装束在帽子内。(五)实验过程中绝对禁止吸烟、饮食等，不要以手抚头面部等。(六)试验前须开启紫外线灯对实验室和操作区域进行照射消毒1小时以上；试验结束后，立即开启紫外灯进行照射消毒2小时以上。(七)任何试验的开始和结束后，操作人员要用70%酒精浸泡双手或仔细擦后，用清洁剂或清水洗净。(八)每次试验结束后，必须清理好实验台，并用70%酒精液或3-5%石炭酸擦洗实验台面。(九)实验室中的生物危险品要根据检查项目和性质不同，局限在相应的试验区间，不得随意将其带到其它的实验室。(十)实验室内任何微生物的样本，废弃物都必须经高温高压灭菌后，方可按一般垃圾处理。6.安全保障(一)首先各级实验室应按等级要求完善实验设施，如简易安全柜内的抽气排风功能、紫外灯消毒功能，生物安全柜维护与除菌滤膜定期更换等。(二)实验室采集病人痰标本时应在户外进行，避免因病人咳漱造成室内气溶胶污染。(三)普通实验室应注意气流方向，实验过程中尽量避免强气流变化而产生气溶胶（如﹕涂片、染色过程中）。(四)细菌的分离培养、菌种开封、转种、研磨、稀释等操作，各级实验室均应在简易安全柜或生物安全柜中进行。(五)使用接种环进行操作时，接种环应在工作灯的内焰中燃烧，以避免菌液或菌块飞溅。(六)稀释菌液时，吸管、针管要缓慢插入试管或烧瓶底部，小心操作避免产生气泡或气溶胶。(七)使用注射器加样时，用过的针头切勿再重新入套或拔开注射器与针头，应直接放入锐器收集器，以免划破皮肤造成接种感染。(八)菌株库要设专人管理，并按照国家微生物菌毒种管理办法执行。(九)进行毒菌操作过程中，不要穿戴巳经污染的防护性手套触摸门柄、仪器或毒菌区以外区域，避免由于粗心扩大污染范围。(十)试验结束后，操作过程中所有可能与生物危险物接触或被污染的试验器械和物品，能够高压消毒的必须高压消毒，不能进行高压消毒的设备、仪器，应使用有效的消毒剂擦洗后再以紫外灯近距离长时间消毒。(十一)实验中发生意外污染情况，应立即通知主管人员并做好处理污染物和相应区域的准备，不得擅自采用其它禁止的方法进行消毒处理。(十二)实验室主任应制定规章和程序，只有告知潜在风险并符合进入实验室特殊要求(如，经过免疫接种)的人，才能进入实验室。(十三)操作致病性微生物时，实验室入口处应贴有生物危险标志，并显示以下信息：有关病原、生物安全级别、免疫接种要求、研究人员姓名、号码、在实验室中必须佩带的个人防护设施、出实验室所要求的程序。(十四)实验室主任为实验室人员特别制定的标准操作程序或生物安全手册中，应包括生物安全程序。对于有特殊风险的人员，要求阅读并在工作及程序上遵照执行。(十五)实验室主任保证实验及其辅助人员接受适当的培训，包括和工作有关的可能存在的风险、防止暴露的必要措施和暴露评估程序。(十六)实验室所用任何个人防护装备应符合国家有关标准的要求。实验室应确保具备足够的有适当防护水平的清洁防护服供使用。还应穿戴其它的个人防护装备，如手套、防护镜、面具、头部面部保护罩等。(十七)处理样本的过程中易产生高危害气溶胶时，要求同时使用适当的个人防护装备、生物安全柜和/或其它物理防护设备。如可产生含生物因子的气溶胶，应在适当的生物安全柜中操作。(十八)实验用鞋应舒适，鞋底防滑。应用皮制或合成材料的不渗液体的鞋类。在从事可能出现漏出的工作时可穿一次性防水鞋套。在实验室的特殊区域（例如有防静电要求的区域）或BSL-3和BSL-4实验室要求使用专用鞋（例如一次性或橡胶靴子）。7.结核病实验室废物处理一、实验室废弃物处理的目的：(一)将操作、收集、运输、处理及处置废弃物的危险减至最小；(二)将实验室废弃物对环境的有害作用减至最小。二、实验室污物处理及消毒(一)实验室含有生物危险物的临床标本及被污染的一次性用品，试验完成后，应在操作台或实验区域内以紫外灯近距离照射消毒2小时以上，再经高压消毒后方可丢弃或焚烧。(二)可重复使用的实验用品及器材，完成实验后，应在操作台或实验区域内经紫外灯近距离照射消毒2小时以上后，再交有关人员进行高压消毒和煮沸洗刷。(三)实验用的试管、吸管、注射器，须装在加盖不漏的容器内，经高压灭菌后取出。(四)培养物或实验室垃圾，在丢弃前必须经高压消毒和紫外灯近距离长时间照射处理。不允许积存垃圾和实验室废弃物。已装满的容器应定期运走。在去污染或最终处置之前，应存放在指定的安全地方，通常在实验室区内。(五)实验室废弃物应置于适当的密封且防漏容器中安全运出实验室。有害气体、气溶胶、污水、废液应经适当的无害化处理后排放，应符合国家相关的要求。(六)实验过程中，如标本或含标本的前消化处理液被打翻污染了操作台或地面，应以吸满70%酒精的卫生纸覆盖污染区，15分钟以后卫生纸方可移去。(七)实验室内未经消毒的污水，禁止直接排入公共排水系统，更不允许混入居民生活垃圾。8.意外事故的处理(一)如果发生意外，必须立即通知实验室主管人员，并在有关人员的指导监督下对出事现场进行处理，绝对禁止未经报告而私自对出事现场给予非规范的处理。(二)实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生，应立即停止实验工作进行紧急处理，更换被污染的实验服，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒或酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗。(三)如果发生菌液溢出，含菌种的培养管破碎等，造成中、小面积污染，可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱脂棉围住，向纱布倾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小时以上（其间适量加溶液防止干燥），再经紫外灯近距离（1米内）照射2小时以上；被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小时以上，实验完成后再进行高压消毒处理。(四)如果发生气溶胶污染或大面积污染，应立即停止实验并关闭实验室，对污染区域进行紫外灯照射消毒过夜；第二天对污染区进行24小时封闭空气熏蒸消毒（乙醛消毒法﹕5ml乙醛＋2g高锰酸钾/m3空间）。(五)绝对禁止使用的事故处理方法﹕1.任何有可能造成污染面积扩大的去污方法，如使用70%乙醇或甲酚皂液擦洗被污染的区域。2.直接用火焰对未经任何处理的污染地面、操作台、器械等进行烧灼处理。3.使用消毒效果未经证实的消毒剂进行消毒。4.使用低浓度的消毒剂和紫外灯进行短时间、长距离的照射。第三章金黄色葡萄球菌的生物危害评估报告1.生物学特性金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。2.危害程度分类根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。3.致病性和感染剂量金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶，有报道目前出现越来越多的耐药菌株，MRSA即耐甲氧西林金黄色葡萄球，菌致病性也随着变强。4.暴露的潜在后果暴露后可能引起感染，菌量大时可使实验人员出现皮肤软组织感染、全身性感染、呼吸道感染、中毒、肠炎等。被感染后，成为传染源，可能对周围及环境造成污染，应及时得到治疗和控制。5.感染途径通过污染食品和水源经口传播，也可通过呼吸道和接触传播。6.微生物在环境中的稳定性葡萄球菌是无芽胞菌中抵抗力最强者，而干燥可达数月，加热80℃7.浓度和浓缩标本的容量一般样本检测。8.自然和易感人群宿主金黄色葡萄球菌常存在于鼻咽喉、下消化道、毛发和皮肤上，在人类和普通的动物都有存在。致病性依照宿主状状，卫生情况，皮肤和黏膜有否创伤而异。当宿主免疫力下降，皮肤黏膜有创伤或卫生情况不好是易感染，特别是老人和婴儿。9.实验操作活动巳有文献证明，金黄色葡萄球菌可造成实验人员化脓性和呼吸道感染，人类不是该菌在唯一传染源，在许多动物身上都存在该菌。这种病原体可以存在于受感染的人或动物的脓液，血液等多种体液中。通过污染食品和水源经口传播，和通过呼吸道和接触传播是该菌的主要传播方式，该菌也是引起院内感染的主要细菌之一。暴露在气溶胶中也可能引起感染。按照国家标准方法对样本（粪便、食品、水样）进行分离，培养，鉴定。建议采用BSL-2级水平的操作技术，防扩散设备和设施。一旦发生意外，按照本实验室的《意外事故应对方案和应急程序》进行处理。10.预防和治疗金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。目前疫苗还不可用于人类。该菌能对人体多部位的感染，所以跟据所致疾病的不同也应采取不同的治疗方案，主要是对症处理和针对病原治疗，大体用药可选用红霉素、新型青霉素、庆大霉素、万古霉素或先锋霉素Ⅵ治疗。预防金黄色葡萄球菌感染，首先是要做好个人卫生，和加强餐饮和食品卫生的管理，及时发现带菌者，做好各种动物的管理工作，把能传播该菌的途径有效的控制好。11.工作人员素质卫生技术专业人员，并经过生物安全培训后获得上岗证书。12.评估结论该菌生物性状较稳定，但抗生素有滥用，也出现了不少的耐药株。该菌主通过污染食品和水源经口传播，也可通过呼吸道和接触传播，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。预防手段主要预防金黄色葡萄球菌感染，首先是要做好个人卫生，和加强餐饮和食品卫生的管理，及时发现带菌者，做好各种动物的管理工作，把能传播该菌的途径有效的控制好。试验过程建仪采用BSL-2级水平的操作技术、防扩散设备和设施。实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。离开实验室时，防护服必须脱下并留在实验室内。不得穿着外出，更不能携带回家。用过的工作服应先在实验室中消毒，然后统一洗涤或丢弃。当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套。如可能发生感染性材料的溢出或溅出，宜戴两副手套。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。操作台面用70%酒精或含氯消毒剂擦拭，废弃物处理按本实验室废弃物处理制度进行。第四章副溶血性弧菌的生物危害评估报告副溶血性弧菌（VibrioParahemolyticus,VP）是一种嗜盐性细菌。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。临床上