石榴皮粗多糖sevage法脱蛋白工艺研究

石榴皮粗多糖sevage法脱蛋白工艺研究

多孔是生命水体不可或缺的一部分。它是一种重要的生物因素，除了蛋白质和氨基酸，而且广泛存在于自然界植物中。近年研究表明,植物多糖在增强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、防衰老、降血糖、降血脂等方面发挥着独特的作用,对促进核酸和蛋白质的生物合成也发挥着重要的作用。多糖丰富的生物学功能,使其在功能性食品和临床医药上广泛应用,多糖生物资源的开发利用和构效关系研究日益活跃。目前,有关石榴皮多糖的研究远未展开,深入研究石榴皮多糖生物学功效的前提是获得纯度均一的多糖,脱蛋白是多糖分离纯化中首要、关键的环节。多糖脱蛋白方法很多,涉及化学法、物理法以及生物法。其中最常用的有Sevage法、离子交换树脂法以及酶法等。其中Sevage法除蛋白操作简单,条件温和,对糖链破坏较小,且所用试剂常规、廉价,是常用的脱除游离蛋白的方法。综合文献发现,多糖来源不同,Sevage法脱蛋白的工艺不尽相同。因此,本研究欲探索Sevage法脱除石榴皮多糖中蛋白的最佳工艺,以期为今后石榴皮多糖的进一步研究和开发利用奠定基础。1试验部分1.1仪器和试剂7230G可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;800型离心沉淀器:上海手术器械厂;RE-52A旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂;SHZ-DC(III)循环水式真空泵:巩义市予华仪器有限公司。无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸、考马斯亮蓝G-250均为分析纯;牛血清蛋白为生化试剂;石榴皮:陕西临潼产甜石榴的新鲜果皮。1.2测试方法1.2.1粗多糖的提取新鲜石榴皮→50℃风干、粉碎→加10倍量蒸馏水→80℃浸提4h→抽滤、离心分离浸提液→残渣复提2次→合并3次浸提液→浓缩→加4倍量无水乙醇醇沉24h→抽滤,分离醇液→沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤→自然晾干,得石榴皮粗多糖。1.2.2sevage试剂单因素试验将1.2.1中得到的石榴皮粗多糖配成5%的水溶液,加入1/3体积的Sevage试剂(V氯仿:V正丁醇=4:1),充分震摇25min,离心10min(4000r/min),弃去下层变性蛋白沉淀,上清液透析,冻干,得脱蛋白的粗多糖产品。单因素试验是在其他条件相同的情况下,分别研究Sevage试剂中氯仿与正丁醇配比(2:1、3:1、4:1、5:1、6:1)、Sevage试剂加入量(1倍、1/2倍、1/3倍、1/4倍、1/5倍)、震摇时间(10、15、20、25、30min)以及脱蛋白次数(1次、2次、3次、4次、5次)等因素对多糖损失率和脱蛋白率的影响。正交试验是在单因素试验基础上,通过分析各因素对多糖损失率和脱蛋白率的影响程度,选取Sevage试剂中氯仿与正丁醇比例、Sevage试剂加入量、震摇时间等3个因素3水平,进行正交试验,确立因素交互影响下的最佳脱蛋白工艺。1.2.3标准曲线的绘制依据硫酸-苯酚法,准确称取2.9mg葡萄糖于50mL容量瓶中加水至刻度线,摇匀,得58μg/mL的葡萄糖标准溶液,分别吸取该溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL于8支干燥试管中,均以蒸馏水补至2.0mL,然后缓慢地加入5%苯酚溶液1.0mL及5.0mL浓H2SO4,摇匀,室温放置20min,以2.0mL蒸馏水管溶液为参比,在光度计上于波长490nm处测定系列溶液的吸光度A。以吸光度(A)为纵坐标,葡萄糖浓度(c)为横坐标,绘制标准曲线为A=0.0171c-0.0092,线性相关系数r=0.9997。取1mL粗多糖稀释液,同法显色后测吸光度值A,代入线性方程,计算脱蛋白前后糖液中相当于葡萄糖的浓度,按如下公式计算多糖损失率:多糖损失率(%)=(脱蛋白前多糖溶液中葡萄糖的含量-脱蛋白后糖液中葡萄糖含量)×100/脱蛋白前多糖溶液中葡萄糖的含量1.3标准曲线的绘制称取50g考马斯亮蓝G-250,溶于25mL95%的乙醇中,加入50mL的浓H3PO4(≥85%),加蒸馏水定容至500mL,得10%的考马斯亮蓝G-250溶液。分别吸取0.1mg/mL牛血清蛋白标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL,补蒸馏水至1mL,各加入5mL配好的10%的考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀,室温静止5min。以试剂空白液为参比,在光度计上于595nm处测定吸光度值A。以蛋白质量m(μg)为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标绘制标准曲线,线性为方程A=0.0046m+0.0056,r=0.9990。取一定体积的多糖稀释液,同法显色后测吸光度值A,代入线性方程,计算脱蛋白前后糖液中蛋白的浓度,按如下公式计算脱蛋白率:脱蛋白率(%)=(脱蛋白前粗多糖溶液中蛋白的含量-脱蛋白后溶液中蛋白质的含量)×100/脱蛋白前粗多糖溶液中蛋白的含量2结果与讨论2.1单因素试验对石榴皮粗糖脱蛋白的影响2.1.1sevage试剂处理前后粗多糖中糖含量和蛋白含量的变化由于文献对Sevage试剂中氯仿与正丁醇的配比各不相同,为了寻找适于脱除石榴皮多糖中蛋白质的最佳配比,试验中准确移取5份2mL5%的石榴皮粗多糖溶液于10mL具塞试管中,分别加入1/4倍体积的由氯仿与正丁醇以2:1、3:1、4:1、5:1、6:1体积比组成的Sevage试剂,振摇15min,离心,取上清液,按照1.3和1.4的方法分析Sevage试剂处理前后粗多糖溶液的糖含量和蛋白含量。平行处理3次取平均值,考察Sevage试剂中氯仿与正丁醇配比对脱除石榴皮粗多糖中蛋白质效果的影响。结果如图1所示。由图1可见,Sevage试剂中氯仿与正丁醇的体积比对脱蛋白率和多糖损失率有一定的影响,随着氯仿与正丁醇体积比的增大,脱蛋白率逐渐增大,在4:1时,达到了最高值,而多糖损失率逐渐降低,但在3:1之后,降低程度不明显。由于氯仿对蛋白变性起主要作用,加入量越多,脱蛋白率越高;正丁醇对多糖溶解起一定的作用,加入量越少,糖损失率越低。结合试验结果,Sevage试剂中氯仿与正丁醇比例为4:1时,多糖损失率较低,脱蛋白效果最为理想。2.1.2处理方法和步骤对比合适的Sevage试剂加入量能保证最好的除蛋白效果和最低的多糖损失率。为此,试验研究了在氯仿与正丁醇的体积比4:1、振摇15min的条件下,分别加入1倍、1/2倍、1/3倍、1/4倍、1/5倍体积的Sevage试剂时,试剂添加量对脱除石榴皮粗多糖中蛋白效果的影响。处理步骤和方法同2.1.1,结果如图2所示。由图2可见,随着Sevage试剂加入量的减少,脱蛋白率和多糖损失率均呈不同程度的递减趋势,在Sevage试剂为多糖体积1倍时脱蛋白率很高,但是多糖损失率也较高。在Sevage试剂加入量为多糖体积的1/2倍时,脱蛋白率接近80%,多糖损失率相对较低,约16%,之后多糖损失率降低缓慢,而脱蛋白率逐渐下降,Sevage试剂加入量为多糖体积的1/2倍时,脱蛋白率接近70%,因此,Sevage试剂加入量为多糖体积的1/2倍时较理想。由图3可见,随着震摇时间的增加,脱蛋白率呈上升趋势,在20min时,达到最大值,之后基本不变;而多糖损失率随着震摇时间的增加,则表现出先减后增的趋势,在震摇时间为15min时,达到最低值,之后又缓慢上升。综合比较,震摇20min时,脱蛋白率和多糖损失率差值较大,脱蛋白效果较满意。2.1.4脱蛋白次数对多糖除蛋白率的影响合适的脱蛋白次数对提高脱蛋白效率和降低多糖损失率有很重要的意义。试验考察了Sevage试剂(氯仿与正丁醇比例为4:1)加入量为多糖溶液体积的1/2倍,震摇时间20min,除蛋白次数分别为1次、2次、3次、4次、5次时对除蛋白效果的影响。结果如图4所示。由图4可见,在脱蛋白次数为1~6次时,脱蛋白次数对除蛋白率影响不大,多糖损失率有增大趋势。因此,对5%的石榴皮多糖溶液在设定条件下,Sevage法脱蛋白1次即可。2.2sevage法脱蛋白及多糖含量检测为了考察各因素在不同水平层次上对脱蛋白率和多糖损失率的交错影响,在单因素试验的基础上,选取对脱蛋白效果影响较明显的氯仿与正丁醇配比、Sevage试剂添加量、震摇时间等3个因素,进行L9(34)正交试验,以优选最佳脱蛋白工艺,因素水平见表1,实验安排见表2。以脱蛋白率(%)和多糖损失率(%)2个指标的差值(%)综合表示脱蛋白效果。表2中K1、K2、K3分别表示Sevage试剂添加量、氯仿与正丁醇比例、震摇时间等3个因素下脱蛋白率(%)和多糖损失率(%)2个指标差值(%)的平均值。R为指标差值的极差。由表2极差分析结果可知:极差RB(5.08)>RC(4.58)>RA(1.83),因此,影响Sevage法脱除石榴皮多糖蛋白质效果的主次因素为B(氯仿与正丁醇的比例)>C(震摇时间)>A(Sevage试剂添加量)。脱蛋白率(%)和多糖损失率(%)2个指标差值(%)越大,标明脱蛋白效果越好,比较K值大小可得最佳的工艺组合条件为A2B2C3,即Sevage试剂添加量为石榴皮多糖体积的1/3,氯仿与正丁醇的比例为4:1,震摇时间为25min,正好为第5组试验结果。2.3白平行试验结果在最佳工艺条件下对5%的石榴皮粗多糖溶液进行5组脱蛋白平行试验,结果标明,5次试验中脱蛋白率平均值为88.46%,RSD为2.39%;多糖损失率平均值为8.05%,RSD为3.36%;可见重复率较好。3粗多糖的脱蛋白、分离通过单因素和L9(34)正交试验,确定了Sevage法脱除石榴皮粗多糖中蛋白质的最佳条件为Sevage试剂中氯仿与正丁醇的比例为4:1、试剂加入量为多糖溶液体积的1/3、震摇时间为25min、脱蛋白1次,此条件下石榴皮粗多糖中蛋白的脱除率达88.46%,多糖损失率为8.05%,脱蛋白效果较好。脱蛋白是多糖提取分离和结构解析的重要步骤,Sevage法作为一种温和的脱除游离蛋白质的方法,随着多糖来源不同,除蛋白的具体条件也可能有所不同。本试验探讨出的石榴皮多糖的Sevage法除蛋白工艺,对石榴皮多糖的进一步纯化、分离奠定了基础。在此基础