《有机酸发酵》丙酮酸发酵过程中光滑球拟酵母过程功能的强化

丙酮酸发酵过程中光滑球拟酵母过程功能的强化第二章第三章绪论第一章第四章调配维生素供给方式强化丙酮酸生产的过程功能奇异流加葡萄糖强化丙酮酸生产的过程功能基于动力学模型调控温度强化丙酮酸发酵的过程功能论文主要内容立题背景和意义第一章基于微生物反应原理的过程功能强化技术

基于系统观点的生物反应过程功能强化技术

基于辅因子工程的生物反应过程功能强化技术基于微生物代谢特性分阶段培养的过程功能强化技术

基于反应动力学模型的发酵过程功能强化技术

基于代谢通量分析(MFA)的发酵过程功能强化技术微生物性能过程性能

生理性能

本课题的目的在于：开发生物基产品制造过程中的过程功能强化策略，有效地提高某些重要发酵产品的生产效率。基于代谢通量分析(MFA)优化T.glabrata生产丙酮酸的营养环境条件

李寅通过构建T.glabrataWSH-IP303菌株以葡萄糖为唯一碳源，以氯化铵为唯一氮源发酵生产丙酮酸的代谢网络，应用代谢通量分析(MFA)方法，得到了不同初始维生素浓度和不同相对溶氧水平下T.glabrataWSH-IP303菌株的胞内代谢通量分布。结合发酵过程中胞内代谢通量分布的变化情况，提出一系列发酵优化策略。国内外研究进展基于调控能量代谢提高光滑球拟酵母生产丙酮酸的速度

刘立明认为，降低胞内ATP含量能显著提高PFK活性和葡萄糖消耗速度以及丙酮酸生产速度，葡萄糖消耗速度的增加是糖酵解途径中关键酶PFK活性和PK活性增加所导致。基于此在对光滑球拟酵母能量代谢途径进行详细分析的基础上，利用诱变育种的方法，选育出一系列能量代谢发生改变的菌株，并结合外部环境提出一系列发酵优化策略。基于辅因子手段实现丙酮酸代谢过程的“开/关”控制

黄慧娟和刘立明认为，而微生物细胞内辅因子的形式和浓度是改变和优化微生物过程功能的关键性因素。而且对于依赖辅因子的代谢途径来说，辅因子的形式和浓度是决定代谢流的流向和通量大小的关键性因素。以光滑球拟酵母中丙酮酸和α-酮戊二酸(α-KG)的代谢为研究模型，研究了辅因子(维生素和金属离子)浓度对碳代谢流的调控。第一章丙酮酸发酵为营养缺陷型发酵，限制性基质的过量添加将导致细胞的过量生长和目的产物的得率降低。以往的丙酮酸发酵营养缺陷因子均为发酵初期一次性添加。

葡萄糖浓度对丙酮酸发酵影响较大，进一步强化丙酮酸发酵过程中T.glabrata的过程功能，需使不同发酵阶段中葡萄糖浓度处于最适水平。而采用合适的葡萄糖流加策略能实现这一目标。T.glabrata发酵生产丙酮酸存在的问题

第一章

温度通过影响T.glabrata的能量代谢从而影响丙酮酸积累的效率。尽管王翠华等系统研究了温度对丙酮酸发酵的影响，但并未提出相应的控温策略。

利用发酵过程参数，通过动力学模型解析影响发酵过程功能的关键因素，提出相应调控策略强化丙酮酸发酵生产过程功能，最终提高丙酮酸发酵的效率的研究则鲜见报道。

T.glabrata发酵生产丙酮酸存在的问题

第一章研究内容:(3个部分)本课题的研究思路和内容第一章

调配维生素供给方式强化丙酮酸生产的过程功能

奇异流加葡萄糖强化丙酮酸生产的过程功能

基于动力学模型调控温度强化丙酮酸发酵的过程功能本课题的研究思路和内容第一章分阶段控制营养物质从底物供给水平的角度上强化动力学模型手段环境条件从生产的调控和发酵过程控制上认识提高生产效率第二章120g/L初始葡萄糖浓度下的丙酮酸发酵过程起始(0-16h)，营养物质充分而且主要用于细胞生长，16h左右时，μ和π逐渐从0增加到0.079h-1

和0.165h-1；π和µ保持在0.15h-1

和0.03h-1以上(17-34h)，然后下降但高于0.01h-1

和0.02h-1(35-64h)；与此同时，丙酮酸对葡萄糖的得率逐渐从16h的0.43g/g增加到64h的0.72g/g；营养物质消耗殆尽，μ和π降低至0。(A)20g/Lglucose;(B)2g/LNH4Cl;(C)1mL/Lvitamin;(D)20g/Lglucoseand2g/LNH4Cl;(E)20g/Lglucoseand1mL/Lvitamin;(F)2g/LNH4Cland1mL/Lvitamin;(G)20g/Lglucose,2g/LNH4Cland1mL/Lvitamin.维生素的匮乏是导致发酵后期细胞活力微弱、残糖较高的主要原因。补加维生素对细胞生长和丙酮酸合成的影响

补加实验G中营养液后，共产生330克丙酮酸，比仅补加葡萄实验高37.5%，比分批发酵实验高46.7%

。第二章维生素的初始添加量显著影响丙酮酸的生产效率及细胞活力。

初始维生素浓度对细胞生长和丙酮酸合成的影响

第二章初始维生素浓度对细胞生长和丙酮酸合成的影响

丙酮酸的生产效率取决于细胞的比生长速率，而比生长速率由维生素的丰度决定。第二章高初始维生素浓度时(14ml/L)，细胞生长的维持时间较长；当µ降低至以下0.04h-1时，曲线斜率为丙酮酸对细胞的得率，随初始维生素浓度的升高而逐渐降低。通过指数流加限制性因子(维生素)是否可将比生长速率控制在目的水平？以最终控制丙酮酸生产效率！分步指数流加维生素策略的提出第二章在最优操作模式下的不同发酵阶段分析

第二章分步指数流加维生素策略的提出(1)共产生401.3g丙酮酸，比分批发酵高75.3%。(2)细胞总量为82.4g，比分批发酵高67.2%。(3)发酵残糖从6.7g/L,降至2.1g/L。(4)发酵时间从67h延至92h，生产强度(1.00g/(L

h)

)与分批发酵接近。第二章第二章本章结论分批发酵后期，残糖较高时，添加适量维生素可以恢复细胞活力；(2)不同的细胞比生速率决定了最终的丙酮酸生产效率。通过指数流加维生素可将比生长速率控制在设定值附近，但控制较高比生长速率(µset为0.05h-1)时最终碳流较多较快的流向细胞生长，导致丙酮酸生产强度(1.20g/(L

h))较高而产率(0.56g/g)较低；(3)提出基于维生素指数流加的比生长速率分步控制策略：在16-34h时将µset定为0.05h-1，在34h和64h分别切换到0.02h-1和0.01h-1，使最终丙酮酸浓度、产率和和生产强度比分批发酵分别提高了34.5%、22.9%和6.9%。

后续研究的思路上述研究表明：维生素作为丙酮酸向葡萄糖转化的“开关”来影响丙酮酸生产的效率，辅因子维生素的开关控制决定了最终葡萄糖向丙酮酸转化的得率和强度。维生素“开关”的上游底物为葡萄糖，葡萄糖的添加量及供给方式对丙酮酸发酵的过程功能的影响如何？是否强化底物葡萄糖的供给会最终强化丙酮酸发酵的性能？丙酮酸分批发酵过程过程动力学模型的构建

第三章在一定的葡萄糖范围内(≤120g/L)，菌体浓度随着初始葡萄糖浓度的增加而增加；继续增加葡萄糖浓度(≥120g/L)则抑制了菌体生长，导致细胞比生长速率下降。模型计算结果与不同初始葡萄糖下的丙酮酸分批发酵结果具有一致性。表明所拟合的模型较好地描述了丙酮酸分批发酵过程。

丙酮酸分批发酵过程过程动力学模型的求解及验证

第三章高初糖浓度下丙酮酸合成、细胞生长抑制严重；低初糖浓度下，无法获得充足发酵底物。葡萄糖流加发酵势在必行！

丙酮酸分批发酵动力学模型分析

第三章当四次补糖时(E4)，丙酮酸产量和得率分别达到78.3g/L和4.96g/g，分别比E1，E2和E3高10.1%，6.4%和3.3%。原因为多次补糖可使葡萄糖浓度维持在较为稳定合适的水平。批次补糖实验

第三章葡萄糖脉冲流加第三章葡萄糖恒速流加第三章采用葡萄糖平均流速分别为1.67g/(L

h)、3.33g/(L

h)和6.67g/(L

h))。3.33g/(L

h)流速最佳。经过72h培养后，丙酮酸产量、得率和生产强度分别达到79.3g/L、0.68g/g和1.1g/(L

h)，比总糖相同的分批发酵分别提高17.7%,15.3%和11.1%。如图所示，当流加速率为3.33g/(L

h))，葡萄糖浓度被控制在20-30g/L，同时避免了低浓度葡萄糖对产酸的限制作用和高浓度葡萄糖对细胞生长的抑制作用。控制不同葡萄糖浓度水平流加第三章较高糖浓度会促进甘油生成，抑制细胞生长，控制葡萄糖浓度20g/L丙酮酸合成效率最高。基于模型的葡萄糖流加过程的准优化控制(1)发酵起始阶段I(0~18h)：Xmax=16.28g/L，YX=0.58g/g理论计算得培养基中葡萄糖浓度大于28g/L时，可获得满足产物合成所需的细胞比生长速率和临界菌体浓度。实际发酵中，添加40g/L葡萄糖；(2)随着葡萄糖浓度降到10g/L以下时，丙酮酸进入介于发酵起始阶段和奇异控制阶段的过渡阶段II(shiftingphase)(19~25h)这一阶段以菌体浓度接近或超过Xmax为目标，快速流加葡萄糖，以满足菌体比生长速率和基质比消耗速率达到最大值碳源需要；(3)奇异控制阶段III(Singularcontrolphase,26~63h)，X接近Xmax，细胞比生长速率μ(s,x)≈0，由方程(3-2)和方程(3-3)得丙酮酸比生成速率π(s,x)和丙酮酸对葡萄糖转化率Y(s,x)分别为：

(4)分批发酵阶段IV(64~84h)：流加结束后维持一定时间使发酵体系中葡萄糖浓度低于5g/L，发酵结束。

第三章葡萄糖流加过程的准优化控制(1)发酵周期缩短了5h；(2)细胞干重提高了24.8%(18.1g/L)；(3)细胞平均比生长速率和葡萄糖比消耗速率分别提高了22.9%和20.7%；(4)丙酮酸浓度、产率和和生产强度分别提高了21.3%、21.6%和29.9%。第三章葡萄糖流加过程的准优化控制第三章本章结论分批补料、恒速流加和恒糖流加等几种培养方式都可以一定程度提高丙酮酸的生产效率。综合比较，控制葡萄糖水平为20g/L的恒糖流加94，丙酮酸产量和得率分别达到83.2g/L和0.69g/g；(2)基于动力学模型的葡萄糖浓度的奇异控制流加策略，使最终丙酮酸浓度、产率和和生产强度分别提高了21.3%、21.6%和29.9%。第三章后续研究的思路葡萄糖的流加一定程度上强化了丙酮酸的生产性能。然而，基于营养物质供给的研究结果在强化丙酮酸主流代谢的同时，并没有削弱或者延迟发酵副产物的生成！尽管王翠华等系统研究了温度对丙酮酸发酵的影响，但并未提出相应的控温策略。实际上，为进一步提高T.glabrata积累丙酮酸的效率，需在对丙酮酸发酵过程中动力学模型及温度与这些模型参数的关系进行详尽分析的基础上，提出最优的温度控制模式，以实现丙酮酸的过量高效积累。不同温度下丙酮酸分批发酵过程

温度对细胞生长、丙酮酸合成、葡萄糖消耗和氮源氯化铵的消耗影响显著！第四章丙酮酸(钠)对细胞生长的影响丙酮酸分批发酵动力学模型第四章丙酮酸发酵动力学模型的构建随着丙酮酸浓度的增加，最终细胞浓度逐渐降低，当丙酮酸达到100g/L时，菌体生长完全受到抑制。依赖于温度的丙酮酸发酵动力学模型方程

温度与动力学参数关系及模型表示第四章依赖于温度的丙酮酸发酵模型方程的验证T.glabrataCCTCCM202019分批发酵生产丙酮酸动力学模型的验证:A(29℃);B(33℃)△Glucose□Pyruvate○DCWModelvalue第四章拟合的模型较好地描述了26-34oC范围内丙酮酸分批发酵过程。不同温度下动力学参数间关系图3模型参数与温度之间的关系第四章30oC时的Xm较26oC和34oC时高36.9%和48.2%µm随温度升高而增大，延滞期缩短。较高的温度下丙酮酸对菌体生长和产酸的抑制作用较强。合适的温度有利于丙酮酸的合成。较高的温度导致发酵后期单位细胞消耗葡萄糖和生产丙酮酸的能力逐渐下降。温度对丙酮酸发酵过程影响解析

(1)延滞期(2)后期第四章X相同，µm随温度升高而增大，细胞生长延滞期随温度的升高而不断缩短。πm随温度升高而增大，即产酸延滞期随着温度的升高而不断缩短。在模型中，令T=34ºC，积分至61h，可计算的X=8.33g/L,P=56.9g/L。当丙酮酸积累至较高浓度时，可以降低温度，减轻丙酮酸对的抑制作用。丙酮酸分批发酵过程中温度控制轨迹

第四章

初始条件：度X0=1g/L，初始丙酮酸浓度P0

=0，初始葡萄糖浓度S0=120g/L控制条件：发酵时间t≤80h，积分时间步长为1h。简化后取26ºC≤T≤34ºC，且为整数取最优控制的目标函数为丙酮酸浓度最大，计算得到丙酮酸分批发酵温度控制轨迹最优温度控制条件下丙酮酸发酵过程最优温度控制条件下和恒定30oC下的丙酮酸发酵过程比较▲Theoptimaltemperaturecontrolstrategy△30℃第四章最优温度控制条件下丙酮酸发酵结果第四章最终发酵周期缩短12h，丙酮酸产量(80.4g/L)、对葡萄糖产率(0.70g/g)和生产强度(1.32g/(L

h))则分别提高了12.9%、6.9%和32.8%

。丙酮酸分批发酵过程中温度控制策略的生理解析

温度为34oC时α-KG的积累量(5.41g/L)为26oC时(0.6g/L)的9倍。不同温度下发酵结束时培养基中的甘油积