膜翅目昆虫干标本的基因组DNA提取

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第27卷第4期2002年10月动物分类学报ACTAZOOTAXONOMICASINICAVol.27,No.4Oct.,2002膜翅目昆虫干标本的基因组DNA提取（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑完整版实用资料，欢迎下载）3国家自然科学基金资助项目(编号39970099.收稿日期:2002Ο04Ο02,修订日期:2002Ο04Ο20.672膜翅目昆虫干标本的基因组DNA提取3朴美花陈学新何俊华(浙江大学应用昆虫学研究所杭州310029摘要提出了膜翅目昆虫干标本基因组DNA的提取方法,通过对实验结果和所测得的基因片段(28SD2rDNA的分析,表明该方法可行。关键词基因组DNA,膜翅目,干标本,提取.中图分类号Q966近年来,昆虫分子系统学和进化研究迅猛发展,对昆虫分子系统发育中常利用的分子标记如mtDNA和rDNA的测序要求快速有效,因此昆虫中有效基因组DNA的提取是重要的前提。许多研究者介绍的基因组DNA的提取方法中所采用的材料基本上是新鲜样品或超低温冷冻标本(Blin&Stafford,1976;Bowtell,1987;Gross2Bellarddetal.,1972;Kupiecetal.,1987;王文和施立明,1993,但是分子系统发育和进化研究中经常出现所研究的类群,特别是稀有类群难以得到新鲜材料的问题,因此往往需要利用自然博物馆或标本馆的干标本提取基因组DNA,但干标本保存时间越长基因组DNA的降解也越严重。因此,如何从干标本中提取基因组DNA的方法对系统发育和进化研究至关重要。本文结合膜翅目寄生性种类分子系统发育研究,对干标本中的基因组DNA的提取方法进行了探索。1材料和方法1.1材料浙江大学应用昆虫学研究所标本馆里保存的分别采于1987年(山东济南,2头、1980年(浙江奉化,2头、1954年(湖南东安,2头及1935年(江苏宜兴,2头的松毛虫脊茧蜂AleiodesesenbeckiHartig(膜翅目:茧蜂科:内茧蜂亚科干标本。每次DNA提取使用较完整的1头松毛虫内茧蜂胸腹部及足,重复进行2次。本实验所采用的松毛虫脊茧蜂标本,采集时用KCN毒死,阴干后制标本,一直保存在密封、控制湿度的标本馆里,因此采集及保存条件几乎完全一致。112设备PCR仪(TECHNEFPROG05D,电泳仪(大连JM2250,台式高速冷冻离心机(SIGMAD237520,恒温金属浴(大和CHB2100,微波炉(GALANZ,匀浆器,紫外透射仪(TANONUV2000,数码相机及其附件(KODAKDC120,紫外分光光度仪(PERKINELMERMBA2000。113基因组DNA提取常规DNA提取方法(Gross2Bellard等,1972通常是:取虫体→碾碎→在37℃下用ProK培育1h→乙酸钠/ETOH沉淀→溶于50mlMilliQ・H2O→-20℃保存。实践表明:常规方法只适用于从新鲜标本中提取基因组DNA,而对干标本却不能获得成功。为了从干标本中提取基因组DNA,笔者摸索了一套新方法,即在利用常规方法之前,进行比较关键性的处理。具体步骤如下:图1基因组DNA的凝胶电泳图谱(GelelectrophoresispatternofgenomeDNAcollectedfromdriedspecimensofAleidesesenbecki11采于1987年(in198721采于1980年(in198031采于1954年(in195441采于1935年(in1935(2用冲洗缓冲液(10mmol/LTris・ClpH810,100mmol/LNaCl,1mmol/LMgCl2冲洗2~3次;(3将虫体(1头昆虫的胸腹部及足磨成粉末;(4加入分离缓冲液(10mmol/LTris・ClpH8.0,10mmol/LEDTA,1%SDS;(5再加入蛋白酶K,37℃水中1h;(6加入5mol/LNaCl混匀,5000g离心数秒;(7等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1反复抽提直到在界面上看不到蛋白质;(8加入1/10体积3mol/LNaAc(pH512,再加入2倍体积的冰冷的100%乙醇,-20℃冰箱中放置015~110h;(950μlMilliQ・H2O溶解DNA。114PCR反应反应体系为:50μl体积,包括500ng以上的模板DNA,015μl215UTaq酶(Promega,5μl10×buffer,4μl25mmol/LMgCl2,1μl20μmol/LPrimers,5μl2mmol/LdNTPs(Promega。引物:引用Dowton&Austin(1998所采用的引物:扩增28SD2rDNA片段的PCR条件:94℃变性3min→30循环(94℃变性30s→54℃,退火1min→72℃延伸1min→72℃延伸8min,获得的28SD2rD2NA片段长度为475bp。从反应混合液中取出8μl扩增产物用118%琼脂糖凝胶(上海东海制药厂进行电泳分析。2结果与分析211不同保存时间干标本中提取的基因组DNA电泳结果图1中,采用本文3中叙述的干标本基因组DNA的提取方法提取了基因组DNA,可以看到1和2有较亮3764期朴美花等:膜翅目昆虫干标本的基因组DNA提取的带,而3和4很难看到亮带,说明采于1987年和1980年的松毛虫脊茧蜂干标本中提取的基因组DNA量较高,而采于1954年和1935年的松毛虫脊茧蜂干标本中抽提的基因组DNA量极少。212用紫外分光光度计测得的OD值表1不同保存时间干标本提取物的OD值(OpticaldensityofdriedspecimensofDNAafterdifferentlengthsofpreservation保存时间14年(采于1987年21年(采于1980年47年(采于1954年66年(采于1935年表1中,看到采于1987年的松毛虫脊茧蜂干标本的基因组DNA得率最高,为312ng/μl,采于1935年的松毛虫脊茧蜂干标本的基因组DNA得率最低,为015ng/μl,表明保存时间长基因组DNA得率明显下降。213新鲜标本和干标本的基因组DNA扩增图2中,利用新鲜标本基因组DNA提取方法抽提干标本基因组DNA,然后进行28SD2rDNA片段的PCR扩增反应,可以看到3有亮带,而1和2无亮带。说明新鲜标本的基因组DNA提取方法不适合于干标本基因组DNA的抽提。因此探索了干标本中基因组DNA提取方法。214不同保存时间干标本的DNA扩增图3中,基因组DNA提取方法采用了本文中叙述的干标本DNA的提取方法,然后进行28SD2rDNA片段的PCR扩增反应,可以看到1和2有亮带,3和4无亮带。说明采于1987年和1980年的松毛虫脊茧蜂干标本中抽提的基因组DNA的PCR扩增得到成功,但采于1954年和1935年的松毛虫脊茧蜂干标本的实验失败,失败原因可能是采于1954年和1935年干标本中没有完整的基因组DNA。3讨论通过实验总结出了从干标本中提取基因组DNA的非常关键的处理措施。首先,在STE缓冲液中浸渍干标本数小时,然后再用冲洗缓冲液冲洗2~3次,这是从干标本中提取基因组DNA的重要环节。因为长时间保存在标本馆或博物馆里的干标本中,基因组DNA的降解严重并且存在影响PCR扩增的因素,所以此方法在基因组DNA提取中大大减少基因组DNA的机械断裂和其它阻断剂,有利于保护干标本基因组DNA,减轻或排除对PCR扩增反应的影响。依此方法对采于1980年和1987年的松毛虫脊茧蜂干标本进行了实验,基因组DNA的提取、PCR扩增及测序均获得了成功,而对采于1935年和1954年的干标本的上述实验均未获得成功,表明该方法适于对20年以内的干标本的基因组DNA的提取。本研究工作对分子系统学和进化研究将具有重要意义,能够充分利用标本室历年来积累的标本,缩短研究时间,节省人力和物力。476动物分类学报27卷图3不同保存时间干标本DNA的PCR扩增产物(28SD2rDNA片段的凝胶电泳图谱(ThegelelectrophoresispatternofPCRamplificationproduct(28SD2rDNAgenefragmentofdriedspeci2mensofDNAofafterdifferentlengthsofpreserationtime,collectedfromAleiodesesenbecki1.采于1987年(in19872.采于1980年(in19803.采于1954年(in19544.采于1935年(in1935M标准分子量(marker图2新鲜标本和干标本DNA的PCR扩增产物(28SD2rDNA片段的凝胶电泳图谱(ThegelelectrophoresispatternofthePCRamplificationproduct(28SD2rDNAgenefragmentoffreshanddriedspecimensofDNA1.采于1987年的松毛虫脊茧蜂干标本(Aleiodesmicroc2ulatusdriedspecimenscollectedin19872.采于1980年的松毛虫脊茧蜂干标本(Aleiodesesenbeckidriedspeci2menscollectedin19803.采于2000年的黑脊茧蜂新鲜标本(Aleiodesesenbeckifreshspecimenscollectedin2000M标准分子量(marker参Biochem,36:32.[王文,施立明,1993.一种改进的动物线立体DNA提取方法.动物学研究,14(2:197~198]5764期朴美花等:膜翅目昆虫干标本的基因组DNA提取676动物分类学报27卷EXTRACTIONOFGENOMEDNAFROMDRIEDSPECIMENSOFHYMENOPTERANINSECTS(INSECTAPIAOMei2HuaCHENXue2XinHEJun2Hua(InstituteofAppliedEntomology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,ChinaAbstractAneffectivemethodofextractinggenomeDNAfromdriedspecimensisimportantforthestudyofmolecularphylogeniticsandevolutionininsects.Thispaperdealswithmethodsofex2tractinggenomeDNAfromdriedspecimensofHymenoptera,usingPCRapparatustoamplifyandsequencethe28SD2rDNAgenesegment.DNAextractionwasdoneasfollows:soakingofmaterialinSTEbufferfor5h,washing223timeswith10mmol/LTris・Cl(pH810,100mmol/LNaCl,1mmol/LMgCl2,grinding,additionof600μl10mmol/LTris・Cl(pH8.0+10mmol/LEDTA+1%SDS+100μgofProteinaseKheatedto37℃for1h.Thehomogenatewasex2tractedwithphenolandthegenomeDNAprecipitatedwith2volumesofethanol.DNAwasredis2olvedin50μlofsterilewaterandstoredat-20℃.PCRswerecarriedoutin50μlvolumescon2taining015μlDNAextracts,2.5UBoehringerTaqpolymerase,5.0μlBoehringerTaqbuffer,2mmol/LdNTPs,16μmol/Lprimer(adoptedDowtonandAustin(1998primersand25mmol/LMgCl2.Cyclingconditionswerethirtycyclesof94℃denaturation(30s,54℃anneal2ing(1minand72℃extension(1min,withaninitialdenaturationof3minat94℃andafinalextensionof72℃for8min.TheresultshowsthatgenomeDNAcouldlebesuccessfullyextactedfromAleiodesesenbeckidriedspecimenscollectedin1987and1980,butnotfromthosecollectedin1954and1935.Basedontheanalysisoftheextractsandgenomesegments,itissuggestedthatthemethodiseffectiveandproductivefordriedspecimenspreservedwithinthelast20years.KeywordsgenomeDNA,Hymenoptera,driedspecimens,extraction.乌镇臭豆干臭豆干全国都有，但乌镇的臭豆干却别具风味。它是用上好的豆干泡制20多个小时而成，而且绝不用化学制剂，只用传统老卤泡制，所以没有异味，香得纯正。传统老卤得来非易，有的店家的老卤已用了数年，每年都添加菜梗、笋根，为防止变质，还不时用烧得通红的铁钳放入卤中杀菌。

将臭豆干在菜油中油炸，串在竹签上，抹上豆瓣辣酱，便是让人难以释口的美味。现在也有饭庄把臭豆干清蒸的，还美其名为“千里飘香”，其实，喜欢臭豆干的食客是根本不顾忌用什么名称的，只要臭得彻底，臭得纯粹。

清代有一首《竹枝词》写到：臭豆腐干腐且臭，臭腐如何可入口；不道世多逐臭夫，买来下粥下饭兼下酒。词里写到的臭豆腐就是我们街头看到，臭味熏天，臭名远扬的臭豆腐干。臭豆干全国都有，各地的臭豆干各式各样，清蒸的、油炸的，黑的、白的，但都臭味相投。其中乌镇的臭豆干配方独特，带有浓郁的江南风味，别具乌镇特色。乌镇臭豆干味道如此出众，秘诀在于采用的传统老卤。老卤除了可以腌制臭豆干外，还可以腌制毛豆角、青菜梗、青南瓜等，但凡是可以吃的几乎都可以放。卤水泡过的菜特别的香，也特别的下饭，是早先农村人家里的必备品。现在很多市面上卖的卤制品虽然干净整洁，但是从味道来说还真没有老卤泡出来的味道好。乌镇臭豆干选用上好的黄豆磨成浆，制成厚薄均匀、四四方方的豆干，将豆干泡制在传统老卤中20多个小时而成。乌镇臭豆干臭味独特之处在于泡制的传统老卤，卤水为绿色，纯天然，不添加任何化学药剂及色素。卤水是用隔年留下的咸菜汁做成，散发出来的是很自然的臭味，臭味中又有咸菜的香味。传统老卤得来非易，有的店家的老卤已用了数年，每年都添加菜梗、笋根，为防止变质，还不时用烧得通红的铁钳放入卤水中杀菌。

臭豆干卤好之后就是油炸了，店家一般把臭豆干码放在一个盒子里，盖上纱布，以防苍蝇虫子叮咬。用特制的长筷将臭豆干放在菜油中油炸，待臭豆干外层呈焦黄色，飘出香味就捞出放在铁架子上让油沥干。依客人口味抹上豆瓣酱辣酱，串在竹签上或是放在小盒子小碗里食用。乌镇臭豆干均是不见其物，先闻奇臭，往往闻到了它的香味，转个角就看到一个老人家在做油炸臭豆干。乌镇臭豆干除了油炸还有其他的吃法，如把臭豆干清蒸的，美其名为“千里飘香”。或是把臭豆干和其他的蔬菜一起蒸，使蔬菜也沾上臭臭的味道。(after------alone)Myfamilyisintheagriculturebusiness.Myfatherisafarmer,myfather’sfatherwasafarmer,myfather’sfather’sfatherwasafarmer.MyfatherexpectsmetobecomeafarmerandjointhemallbutIdon’tagreewithmyfather.Threeyearsago,onasunnyafternoon,IfollowedFathertotheairporttovisitoneofhisfriends.Hisfriendownedasmallairlinewithtwosmallaircrafts.ItwasthefirsttimeIhadseenanairplane.Aftermyfather’sfrienddiscoveredIhadneverbeeninanairplane,heallowedmetoflywithhim.Whenwetookoff,Ifeltalive.Whilewewereintheair,IalmostforgotIhadtoreturntotheground.AllIcouldthinkofwasflyingwouldbemyaiminlifeandhowIwantedtoflyagainandagain.WhenIhadtime,myfather’sfriendwouldteachmehowtofly.Heevenletmeflyaloneonce.IwantedtobecomeapilotbutIwouldhavetogoagainstmyfather.Attheageof18,IhadtotellmyfatherwhatIwantedtodobutIdidn’twanttoalarmhim.AshewalkedaheadofmeandIfollowedafter,Ididn’tkn