直接注射移植eg细胞对大鼠心肌梗死的影响

直接注射移植eg细胞对大鼠心肌梗死的影响

心脏病（mi）是一个危及人类健康的系统性问题。并发症、心力衰竭和心律失常是许多患者死亡的主要原因。MI后如何修复坏死心肌,仍是困扰人们的一个难题。细胞移植治疗急性MI是通过移植具有分化潜能的各种干细胞至MI区,使其在梗死区增殖分化为心肌组织,进而改善心功能。在全世界范围内胚胎干细胞移植治疗MI的研究已开展十余年,但人胚胎生殖细胞(embryonicgerm,EG细胞)移植大鼠MI区尚未见报道。本研究将人EG细胞直接注射移植大鼠MI区,观察、鉴定该区的人EG细胞存活和分化为心肌细胞,为人胚胎生殖细胞治疗MI提供实验依据。材料和方法一、维细胞生长因子和确定转录因子DMEM培养基(GIBCO/BRL,高糖)、胎牛血清(Hyclone,新西兰产);碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF,R&D公司);鼠抗人细胞核单克隆抗体(MAB1281,Chemichon公司);心肌形成转录因子Nkx2.5(R&D公司);EnVision检测试剂盒(GK500705,GeneTech,盒中包括通用型二抗,DAB及稀释液)。二、心梗模型的制作清洁级SD大鼠40只(本校实验动物中心提供),雌雄不拘,体重200～250g,饲养环境为清洁级。随机分两组,移植组(28只),对照组12只。4%水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠,胸骨左缘3～4肋间隙进入胸腔,打开心包膜,充分暴露心脏,5-0丝线缝扎左冠状动脉前降支。针形电极插入四肢皮下,记录标准Ⅱ导联心电图,出现ST段弓背持续性抬高的典型心梗心电图变化,说明心梗模型制作成功。术后肌肉注射青霉素40万单位以预防感染,并在30℃条件下苏醒。全手术过程为无菌操作,术后不需拆线。假手术组:仅在左心耳下缘与肺动脉圆锥间左冠状动脉前降支位置用同样大小的无创缝合针穿过该血管下方而不打结,其余操作与手术组相同。移植组将人EG细胞直接注入梗死心肌边缘,分4点各点注入12μl细胞悬液;对照组在MI区边缘分4点各点注入12μl磷酸缓冲液(PBS)。三、胚胎污染情况收集苏州大学附属第一、第二医院妇产科及苏州市妇幼保健中心人工中止妊娠的5～10周人胚胎,每例胚胎均经孕妇和道义委员会同意,胚胎需完整,无严重污染。组织块培养法体外培养8周龄人胚胎的生殖腺嵴,以添加白血病抑制因子(LIF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),含15%胎牛血清DMEM高糖培养液为培养体系,获得生长于同源人胚成纤维细胞饲养层上的人EG细胞及细胞集落,采用消化传代法对原代培养第8日的细胞进行传代培养至第4代。四、细胞回缩和培养移植前1h,以无菌接种针挑取传代培养至第4代人EG细胞集落,0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化,待细胞发生胞质回缩,细胞集落分散开时,即加含血清培养基终止消化,用吸管反复轻轻吹打瓶底,使细胞成为均匀的单细胞悬液,用无菌PBS离心洗涤2次,将细胞吹打均匀,计数板计数,调密度至1×106/ml。以微量注射器吸取50μl,置4℃待用。五、人eg细胞pbs在MI的模型上,直视用微量注射器在MI区边缘分4点各注入12μl人EG细胞悬液,密度1×106/ml,对照组以同样方法注入等量无菌PBS。关胸,维持辅助呼吸至自主呼吸恢复,送回笼中饲养。六、石蜡切片和免疫移植后1d、1、2、4周,分别取移植组7只和对照组3只大鼠,4%水合氯醛腹腔注射麻醉,剖胸取心,PBS冲洗血液,去除左右心房和右心室,将左心室部位用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,石蜡切片采用二步法进行免疫组织化学标记,一抗分别为鼠抗人细胞核单抗(1∶100,MAB1281)和心肌形成转录因子Nkx2.5的抗Nkx2.5单抗(1∶100),二抗为通用型二抗,显微镜下观察。实验严格按照说明书进行操作。结果一、人eg细胞传代培养培养瓶内刚种入的组织块呈白色透明状,培养12h后,在组织块周围可见少量胚胎成纤维细胞伸展出来,细胞呈星形多突起,贴壁生长。随着添加培养液及培养时间的延长,成纤维细胞数目逐渐增多,细胞形态良好,并铺满培养瓶底,形成饲养层细胞,原始生殖细胞形成的EG细胞集落生长在饲养层细胞之上,细胞大而圆,轮廓较清,细胞核大,核质比高,偏心位。培养4d后,在成纤维细胞的上面出现界限清的EG细胞集落,集落内的细胞之间排列紧密,形成典型的“鸟巢”状结构,集落内细胞界限不清。传代后24h,人EG细胞单个散在分布,可见少量胚胎成纤维细胞。48h,人EG细胞生长旺盛,聚集成多个细胞团块(见封三图1)。传代培养至第4代,人EG细胞集落大小同前(见封三图2)。二、心电图检查及其结果手术组大鼠在缝扎左冠状动脉前降支后肉眼可见结扎线远端有明显的、一定范围的心肌活动度减弱或消失,心肌颜色明显变苍白。心电图检查显示:手术组大鼠在缝扎1～20min后出现不同程度心电图肢体导联ST段弓背向上抬高,出现病理性Q波。假手术组则无异常。三、mi区mab1281表达细胞的形态移植后1d,可见沿心外膜有MAB1281阳性表达的细胞,细胞为圆形,细胞核深棕褐色,排列无序(见封三图3A);移植后1周,MI区心肌纤维坏死,排列紊乱,在心肌细胞周围有棕色的MAB1281阳性表达的细胞分布,呈细长梭形(见封三图3B);移植后2周,MI区心肌层,MAB1281阳性表达的细胞呈长梭形,核卵圆形,被染为棕黄色,与心肌细胞平行排列(见封三图3C);移植后4周,MI区大部分为MAB1281阳性表达的细胞,细胞短柱形,细胞核棕黄色,心肌层细胞排列整齐(见封三图3D)。对照组MAB1281阴性表达(见封三图4)。四、血管周围阳性表达细胞移植后1d,在注射点周围的心肌层可见少量的NKx-2.5阳性表达细胞,聚集成团,细胞核为椭圆形,染色为棕褐色(见封三图6A);移植后1周,在心外膜的血管周围可见有大量散在的NKx2.5阳性表达细胞,散在分布于心肌纤维周边,细胞核呈梭形,染色为棕褐色(见封三图6B);移植后2周,在MI区心肌纤维排列紊乱,多见NKx2.5阳性表达细胞,细胞核呈梭形,为类幼稚心肌细胞形态,核染色为棕褐色(见封三图6C);移植后4周,在心肌层阳性表达扩散明显,细胞排列在残存的宿主心肌细胞之间,与宿主细胞排列方向一致,细胞核呈长梭形或椭圆形,染色为棕褐色(见封三图6D);对照组中NKx2.5为阴性表达(见封三图5)。第二,对大鼠mab1281表达的认识由于MI后心肌细胞大量丧失,导致心脏解剖学改变和左心室重构的发生,并最终导致心力衰竭。然而无论是冠状动脉血运重建术还是药物治疗都不能从根本上改变心肌细胞数量的绝对减少和左心室的重构。干细胞移植治疗就是通过植入外源性细胞,再生具有正常功能的心肌细胞,从而抑制瘢痕组织形成,改善心功能。我们的研究以鼠抗人细胞核单克隆抗体(MAB1281)作为示踪剂,进行免疫组化检测。鼠抗人细胞核单克隆抗体MAB1281具有很强的种属特异性。我们的实验结果显示:移植的人EG细胞(MAB1281阳性表达细胞)在移植后的1天、1、2周和4周,人EG细胞逐渐由心外膜层迁移至心肌层,绝大部分向梗死区域内部迁移,极少数细胞向正常心肌区域迁移。对照组大鼠直接注射等量的PBS,免疫组织化学的切片中检测不到MAB1281阳性表达细胞。心肌形成转录因子Nkx.5是编码转录因子的同源盒基因超家族,是与果蝇的NK2、NK3和NK4/msh-2相关的一个同源盒基因SP亚家族的新成员。Nkx2.5所编码的转录因子主要在胚胎发育和个体发生的关键部位起作用。有人观察到,Nkx2.5转录最早发生于胚胎发育早期头褶形成期的心肌祖细胞中,并在胚胎和胎儿心脏的心肌细胞持续表达。Nkx2.5是心肌发生的最早期标志,是心肌形成的启动基因,决定干细胞向心肌细胞的定向分化,在干细胞向心肌分化研究中具有重要意义。本研究把人胚胎生殖干细胞植入大鼠MI后1天、1、2和4周