第五章 基因工程研究生09

南昌大学医学院万福生第五章

GeneticEngineering基因工程1基因工程（geneticengineering）是人们在对自然界基因重组和基因转移的认识上发展起来的一门分子生物学技术。基因工程的重要特点是在分子水平上操作，细胞水平上表达。它的诞生和发展，不但为生命科学的理论研究提供了崭新的技术手段，而且为医学领域的发展开辟了广阔的前景。2DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。

3生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。4重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。5第二节

基因工程的物质基础

第三节

基因克隆的基本过程第四节克隆基因的表达第五节基因工程技术与医学的发展

第一节

基因工程的基本原理

6第一节基因工程的基本原理

一、基因工程技术的诞生及意义

二、基因工程技术的基本原理7第二节基因工程的物质基础一、工具酶

（一）限制性核酸内切酶（二）DNA聚合酶(三)DNA连接酶(四)其它DNA修饰酶8（一）限制性核酸内切酶

限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。限制性核酸内切酶分为三类，在基因工程操作中所说的限制酶，通常指Ⅱ类限制性核酸内切酶。9定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶,简称限制酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ10作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）11第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶12Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG13BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口14同功异源酶来源不同，但能识别和切割同一位点的限制酶，称为同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ15同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA16限制酶的性质和作用特点

限制酶识别序列的长度一般为4-6个核苷酸。切割DNA分子中的磷酸二酯键，产生5´-P、3´-OH的DNA片段。限制酶切割DNA分子形成黏性末端(stickyend)和平末端或钝末端(bluntend)两种。

175´…CTGCAG…3´PstⅠ识别序列

3´…GACGTC…5´形成3´-OH黏性末端

5´…GAATTC…3´EcoRⅠ识别序列

3´…CTTAAG…5´形成5´-P黏性末端

5´…AGCT…3´Alu

Ⅰ识别序列

3´…TCGA…5´切割后形成平末端

18限制性核酸内切酶的用途:

①改造和构建新质粒；②建立DNA物理图谱；③基因组DNA同源性研究；④基因克隆；⑤DNA分子杂交及序列分析；⑥制备DNA放射性探针；⑦DNA甲基化碱基的识别与切割等。

19（二）DNA连接酶DNA连接酶（DNAligase）是基因工程中所必需的一类酶。它能催化DNA中相邻的5´-磷酸基和3´-羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA单链缺口连接起来，形成完整DNA分子。在基因工程中，最常用的DNA连接酶为T4DNA连接酶。

203´5´失去磷酸二酯键的缺口连接酶封闭缺口DNA连接酶连接双链中的单链缺口21表8-1重组DNA技术中常用的工具酶

酶的名称功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA聚合酶①合成双链cDNA的第二条链②缺口平移制作高比活探针③填补3´末端逆转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析DNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成的磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基22二基因载体定义载体（vector）为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。它是能携带外源DNA分子进入受体细胞并进行扩增和表达的运载工具。常用载体质粒DNA,噬菌体DNA,病毒DNA.23（一）克隆载体1.质粒载体2.噬菌体载体3.酵母人工染色体载体

（二）表达载体1.大肠杆菌表达载体2.真核表达载体基因载体种类24克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)

为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。25基因载体应具备的条件：①具有自主复制能力；②有多个单一限制酶的酶切位点或多克隆位点（MCS）③具有一个或多个选择性遗传标记④分子量小，能容纳较大的外源DNA分子⑤具有较高拷贝数，便于分离提纯；⑥具有较高的遗传稳定性。

26

（一）克隆载体1.质粒

质粒（plasmid）是存在于细菌染色体之外的、具有自主复制能力的双链环状DNA分子。常用的质粒载体有pBR322(图8-3)、pUC系列及TA克隆载体等多种。

27特点

能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。28293031pUC系列载体的优点：①具有较小的分子量和较高的拷贝数。②适用于组织化学方法检测重组体。③pUC载体系列的MCS与M13mp系列对应，因此克隆的外源DNA片段就可以在两类载体系列之间来回“穿梭”，使得克隆序列的测序极为方便。

32

TA克隆载体是专为克隆PCR产物而设计的一种特殊质粒载体，它们的共同点是在其多克隆位点两侧的3´末端携带有未配对的T碱基，多克隆位点均位于

半乳糖苷酶的

肽编码区内和都含有T7启动子。由于大部分耐热的DNA聚合酶（如Taq、Tth等）扩增时都会有在PCR产物3´末端加上一个A碱基的特性，可与载体3´末端的T互补连接，同时3´端T突出端可以防此载体的自身环化，可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。常见TA载体有pBS-T、pGM-T、pCF-T、pGW-T等。3334

352.噬菌体(bacteriophage，phage)M13噬菌体是一类细菌病毒，其为单链环状DNA分子,可用于克隆和扩增特定的DNA片段，是广泛使用克隆载体。M13噬菌体优点：一是允许包装大于病毒单位长度的外源DNA；二是它感染细菌后，其复制型是双链，分泌出来的则是单链。因此，M13噬菌体可用于DNA序列分析，制备单链DNA(探针)及进行定点突变研究等。3637

为了便于克隆外源DNA片段,在野生型噬菌体基因Ⅱ和基因Ⅳ之间插入lacy启动子-操纵元件序列扩编码β-半乳糖苷酶前145个氨基酸的核苷酸序列,并有多克隆位点,依据这些位点序列不同,构成M13mp系列,如M13mp2,M13mp10,M13mp18,M13mp19等.当细菌内复制型M13的拷贝数累积到100-200后,DNA的合成就变成不对称,只有一条链进行复制,从而产生大量的DNA单链,并包装到成熟的噬菌体颗粒中,然后排出细菌体外.38λ噬菌体DNA改造系统:λgt系列（插入型):能克隆7kb以下的外源DNA片段,适用cDNA克隆.EMBL系列（置换型):替代片段大小为9-23kb,适用基因组克隆.

39粘性质粒(cosmid)粘性质粒又称粘粒,由λ噬菌体DNA的cos区与质粒重新构建的载体,为双链环状DNA,具有与质粒相同的结构,但克隆容量比质粒大,其容量可达40-50kb.粘性质粒的特点为:

1.具有质粒的抗药性标记,如Ampr或Tetr基因及其复制成分;2.具有λ噬菌体的cos区,这是体外包装必须的成分;3.具有一个以上限制酶酶切位点;4.因非重组的粘粒很小,不能进行体外包装,有利于重组体的筛选.403.酵母人工染色体载体(YAC)

YAC是第一个成功构建的人工染色体载体，也是目前能容纳最大量(100万bp)外源DNA片段的载体.典型的YAC载体结构及基因克隆过程如下图所示。

4142（二）表达载体（expressingvector）

表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体，它除了具有克隆载体所具有的性质外，还需要有能表达外源基因所必需的DNA序列（如启动子、核糖体结合位点和转录终止调控序列等）。按宿主细胞的不同，可将表达载体又分为原核细胞表达载体、酵母细胞表达载体、哺乳动物细胞表达载体和昆虫细胞表达载体。43pRSET载体

它是一个两用载体，它既可作为表达融合型蛋白的载体，也可作为表达非融合型蛋白的载体。该载体含有Amp抗性基因和一个强的T7噬菌体启动子，在启动子与终止信号之间有RBS和多克隆位点。4445

46

真核表达载体都含有一套真核表达元件，即启动子/增强子、克隆位点、终止信号和加工poly(A)的信号。如pcDNA3.1载体（见图8-13）是常用的真核表达载体之一。该载体含有一个高效表达的CMV启动子、多克隆位点、原核细胞复制起始点、用于原核细胞筛选的Amp抗性基因和真核细胞筛选的抗性基因(Neor)及小牛生长激素的poly(A)。47

48

腺相关病毒（Adeno-associatedvirus,AAV）是一种细小病毒科依赖病毒属的单链DNA病毒。基因组全长4.6kb，共含2个结构基因，分别编码病毒复制和组装必需的蛋白质。基因组两端的反向末端重复序列（ITR）是腺相关病毒复制、整合及包装所必需的顺式作用元件。AAV载体可用于体内或体外感染肌肉、神经、肝及造血细胞，目前多用于

-地中海贫血等单基因遗传病基因治疗的载体。

49

AAV载体的优点：①可感染多种细胞，包括非分裂期细胞；②免疫原性小、毒性低和致病性弱；③能特异地整合到人的19号染色体中;④它介导整合到人染色体中的外源基因能在人染色体中长期稳定表达。其不足之处:成熟病毒颗粒的形成需腺病毒或疱疹病毒协助和容纳外源基因的容量较小（约4kb）。用外源基因及其调控序列置换AVV的结构基因，保留其两端的ITR结构，可构建腺相关病毒重组载体，用于基因治疗。但重组AVV大多失去了野生型病毒整合人靶细胞基因组的特异性。50第三节基因克隆的基本过程基因克隆的基本过程主要应包括：①目的基因的获取；②基因载体的选择与构建；③基因载体与目的基因的连接（构建DNA重组体）；④DNA重组体导入受体细胞；⑤含DNA重组体细胞（转化子）或菌落的筛选与鉴定。51基因克隆的基本过程

载体目的基因重组DNA分子细菌转化扩增52

53一、目的基因的获取(一)直接从基因组DNA中分离(二)化学合成法(三)逆转录法(四)聚合酶链反应(五)从基因文库中筛选获得541.化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列55组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合2.从基因组DNA文库获取目的基因目录56限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录57mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶

载体

受体菌

复制3.从cDNA文库获取目的基因

逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录584.聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）方法PCR实际上是一种利用酶反应在体外获得基因组中特异的DNA序列或cDNA序列方法，多采用RT-PCR.该方法的特点是简便、快捷、特异性强、灵敏度高，是目前分子生物学中应用最广的新技术。另外,近来mRNA差异显示技术和差异蛋白质谱表达技术也被用来筛选差异表达基因和功能基因。

595

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

5

5

5

5

5

5

一、基本工作原理目录60Cycle35

5

5

5

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5

5

5

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5

5

5

5

5

5

5

25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录61模板DNA

特异性引物耐热DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR体系基本组成成分62PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C63（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析四、PCR的主要用途64几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术65实时PCR技术原理目录66二、基因载体的选择与制备基因克隆中基因载体的选择与构建是一项技术性很强的工作，它直接影响到基因克隆的成败。一般应从目的基因、所用限制酶及受体菌（细胞）的特性综合考虑。67三、DNA重组体的构建（一）目的基因与基因载体的连接1.粘端连接法2.平端连接法3.人工接头连接法4.同聚物加尾连接法681.

粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接69BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体目的基因自连载体自连同一限制酶切位点连接目录70不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录712.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端72目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录733.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。745´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录754.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

76人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录77（二）影响目的基因与载体连接的因素1.连接酶的活性大小2.连接反应的温度3.目的基因与载体DNA的比例

78

连接酶的抑制剂:

目的基因与载体连接反应的实质是连接酶对两种DNA片段末端之间的催化反应，连接酶的活性大小直接影响到连接效果。连接酶的活性能被5mmol/L磷酸盐、25mmol/LNaCl和0.1mmol/LCa2+离子所抑制。所以，在连接反应中一定不能含有上述试剂，特别是当要求用高盐缓冲液的酶消化DNA后，必须用乙醇沉淀DNA以除去盐和限制酶，然后加入连接缓冲液进行连接反应。79

连接反应条件:

对粘性末端片段的连接反应温度一般为12℃～15℃，反应过夜；对平末端片段的连接反应温度一般在室温（22℃～25℃）下进行。ATP的失活往往也是连接反应失败的重要原因之一。配制的ATP母液要分装、冰冻保存，使用前取出在冷水中融化，放在冰上备用。80

目的基因与载体DNA的比例:目的基因/载体DNA摩尔浓度的比值一般为2～3，这样能得到较高的重组率。连接反应中DNA总浓度不能过高，一般以1～50

g/ml为宜，在DNA总浓度小于20

g/ml范围内，重组率与DNA浓度成正比例。81

表8-2部分常用的限制性核酸内切酶

DNA总浓度pM-V/pM-I转化子/重组子%(V+I）(μgV-DNA)(μg/mL)

12:17.0*1055.052:16.5*1057.0102:16.0*10514

202:14.5*10522502:12.0*1055.011:27.0*1052.0101:26.5*10530201:26.5*1052282四、重组DNA导入受体细胞

细胞(细菌)处于容易接受外源DNA状态叫感受态(competence)。细菌生物学特性由于吸源收外DNA发生可遗传的表型变化叫转化(transformation).通常将重组体导入原核细胞的过程称为转化，重组体导入真核细胞的过程称转染(transfection)，而由病毒载体构建的重组体导入细胞(细菌)被称为感染(infection)。常用受体细胞包括原核细胞（如大肠杆菌）和真核细胞（如酵母、哺乳动物及昆虫细胞等）。83真核细胞中介导基因转染方法（一）磷酸钙共沉淀法（二）脂质体法（三）DEAE-葡聚糖介导转染法（四）电穿孔法（五）显微注射法84五、筛选与鉴定将重组体引入受体菌(细胞)，并经初步扩增后，应进行筛选，即从大量转化菌落或噬菌斑中选择和鉴定出含有目的基因的菌株(细胞)，这一过程就称为筛选(Screening)或选择(Selection)。

85（一）根据DNA重组体表型筛选1.插入灭活法2.α-互补筛选法（二）限制酶酶谱分析法（三）核酸分子杂交（四）PCR扩增法（五）核酸序列测定（六）免疫学方法86(插入失活法)抗药性标记选择目录87组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救目录88α互补目录89

α互补的检测目录90原位杂交目录91Southernblot目录92鸡的β肌球蛋白的克隆和检出目录93三、克隆基因在其它表达系统中的表达(一)杆状病毒表达系统

杆状病毒主要感染鳞翅目、双翅目和膜翅目类昆虫，具有高度特异性的宿主范围，对人、畜及其它动物无害。(二)果蝇表达系统果蝇表达系统是非溶解性的，使用果蝇S2细胞为受体细胞，载体含有MT启动子和Ac5启动子。表达载体可连续表达，也可诱导表达。

94重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录95第四节克隆基因的表达一、克隆基因在原核细胞中的表达（一）真核基因在大肠杆菌中表达的基本要求（二）提高外源基因表达水平的方法二、克隆基因在真核细胞中的表达（一）酵母表达系统（二）哺乳动物细胞表达系统（三）哺乳动物细胞基因转染的筛选96（一）真核基因在大肠杆菌表达的基本要求真核基因在原核细胞中表达的基本条件:①其5´端不能带有非编码区和内含子②外源基因必须置于原核细胞的强启动子（如PL、trp-lac及T7）和SD序列等调控元件下游。③外源基因与表达载体重组后，必须形成正确的开放阅读框架。④外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并能被有效翻译，所表达蛋白质产物对宿主菌无毒害作用，且不易被宿主菌的蛋白酶降解。97（二）提高外源基因表达水平的方式1.提高翻译水平主要策略和措施有：①调节SD序列与ATG之间的距离,一般为5-9个碱基。②利用密码的简并性合成一组恰当的密码子，以提高翻译效率。③增加mRNA的稳定性。2.错开目的基因表达与细菌生长的时间3.提高目的蛋白的稳定性4.增加转化细胞（菌）中目的基因的拷贝数98（三）哺乳动物细胞基因转染后的筛选目前常用于筛选的基因有以下几种：1.

新霉素抗性基因2.胸苷激酶基因(thymidinekinase,TK）3.二氢叶酸还原酶基因（DHFR）4.氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)

99（四）外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物一般为四种形式：①融合蛋白(fusionprotein)：

指将外源基因与另一基因相拼接构成融合基因进行表达，这种由原核生物多和外源目的蛋白结合在一起的蛋白称融合蛋白。需要使用融合表达载体，如pET、pGEX系列载体等。其特点是利用与外源蛋白融合表达的特殊短肽（如6个组氨酸）或多肽（如谷光苷肽巯基转移酶，GST）作为标签，便于分离目的蛋白。100

融合蛋白表达的特点：A.融合蛋白表达的效率高；B.融合蛋白可抵抗细菌蛋白酶的降解；

C.大多数融合蛋白有较好的水溶性及构象；

D.常带有特殊标记，便于纯化。②非融合蛋白：非融合型表达的蛋白具有近似天然蛋白质的结构，其生物学活性也更接近天然蛋白质。其不足是易被细菌蛋白酶降解。101

③：分泌型蛋白：

是利用分泌型表达载体将表达的蛋白质经胞质跨膜分泌到胞外，这需要在信号肽的帮助下进行。即在SD序列下游要有一段信号肽序列。分泌型蛋白可以是融合蛋白，也可以是非融合蛋白。表达分泌型蛋白的优点：一是可防止宿主蛋白酶对表达蛋白的降解；二是有利于表达蛋白在胞外正确折叠和分离纯化；三是能减轻宿主（如大肠杆菌）的负荷。不足之处：表达量往往较低，需要切除信号肽或信号肽切除错误。102

④包含体（inclusionbody）形式：

它是指所表达的蛋白质很致密地集聚在细胞内或被膜包裹形成的水不溶性结构称为包含体.它是无定型的蛋白聚合物，其中约50%为目的基因产物，还有宿主细胞蛋白片段及少量的脂多糖、DNA、RNA。包含体中目的蛋白的一级结构是正确的，但空间结构是错误的，重组蛋白失去原有生物学活性，需要复性操作以获得有活性的目的蛋白。其优点是可表达对宿主细胞有害甚至致死的目的蛋白，且表达的目的蛋白结构稳定，不被宿主蛋白酶降解。103包含体蛋白分离纯化方法一般步骤:

①破碎细胞，离心分离包含体，②用1%以下的中性去污剂如TritonX-100或盐酸胍等洗涤，去除吸附在包含体表面的不溶性蛋白。③用高浓度的变性剂如8～10mol/L尿素或5～8mol/L盐酸胍溶解包含体。④对重组蛋白进行复性处理，最简单的方法可用适当缓冲液透析，除去变性剂使蛋白质在适当条件下重新折叠成有生物活性的蛋白质。

104重组蛋白的活性与下列因素有关：①分泌型蛋白质分子表面是否正确接上糖链，②是否正确形成二硫键，③是否形成具有生物活性的天然构象，④以溶解状态还是聚集在包含体中？105第五节用DNA重组技术生产人胰岛素1921年，F.G.Banting和C.H.Best发现提取了胰岛素（insulin），之后与J.B.Collip和J.J.R.Macleod共同研究将胰岛素用于糖尿病治疗，为此Banting和Macleod于1923年获得诺贝尔生理学或医学奖。鉴于胰岛素的重要临床价值和DNA重组技术应用研究的逐渐深入，国际上开始有不同的医药公司进行基因工程胰岛素的研究与开发。1978年，美国Genentech公司首次实现了利用大肠杆菌生产由人工合成基因表达的人胰岛素。106

1982年，美国EliLilly公司首先将由基因工程菌生产的药物—胰岛素投放市场，重组人胰岛素的开发生产标志着世界第一个基因工程药物的诞生。1987年，丹麦Novonordisk公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。2000年全球的胰岛素销售额为300亿美元，2003年已达到600亿美元，而基因工程胰岛素正占据越来越大的比例。Novonordisk公司的诺和灵(Insulin)、EliLilly公司的优泌林（Humulin）和优泌乐（Humalog）是销售额最大的三个基因工程胰岛素产品，全球年销售额都超过10亿美元。107一、人胰岛素的生产方法

迄今为止，主要有以下几种生产人胰岛素的方法：（一）直接提取法这是早期生产人胰岛素的方法，直接从人的胰脏中分离纯化获取。该方法由于受原料供应的限制，其产量远远不能满足糖尿病人的临床需求。（二）化学合成法我国生物化学家花费8年时间于20世纪60年代中期，在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，这项成就开创了世界上人工合成蛋白质的新纪元，成为中国人永远为之骄傲的辉煌。108

（三）化学转型法此法是将动物胰岛素进行化学处理，使其转变成人胰岛素。如猪的胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸残基的差异，因此在体外控制合适的反应条件，可将猪胰岛素酶促转化为人胰岛素。该过程的总转化效率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，因此产品的价格往往较高。另外，从动物（猪或牛）的胰脏组织中提取胰岛素，虽然原料相对丰富，但也面临含量低，产量少，价格高等问题。109（四）DNA重组技术制备法上述生产人胰岛素方法的种种不利因素，医药公司就尝试利用DNA重组技术生产重组人胰岛素，EliLilly公司于1982年成功将重组人胰岛素投放市场。