实验1大肠杆菌的培养与分离(浙科版选修1)

浙科版生物选修（1）

生物技术实践

IB模块1-1什么是生物技术生物技术=生物工程应用自然科学及工程学原理，以微生物体、动物体、植物体或其组成部分作为生物反应器将物料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。1-2传统生物技术传统生物技术指主要通过微生物的发酵来生产商品.如:酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶等1-3现代生物技术一般而言，現代生物技术可以分成以下五种：一、细胞工程二、发酵工程 三、蛋白质工程四、酶工程五、基因工程

现代生物技术与传统生物技术的本质区别是现代生物技术中用到了基因工程。

一、细胞工程

按照人们的需要和科学设计改变细胞的遗传基础，并通过细胞(组织)培养，细胞杂交(融合)，核移植和胚胎移植等技术，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。

二、发酵工程

微生物的无氧呼吸叫发酵1.定义：利用DNA重组技术对不同生物的遗传基因，根据人们的意愿，进行基因的切割、拼接及重新组合，再转入生物体內，产生出人们所期望的产物或创造出具有新的遗传特征的生物类型。蛋白质工程主要包括了解合成蛋白质的DNA编码序列、蛋白质的分离纯化、蛋白质的序列分析和结构功能分析、蛋白质结晶和结构力学分析等。三、蛋白质工程

酶工程即利用基因工程等手段，改变酶或蛋白质的折叠方式、空间结构、催化活性和稳定性等四、酶工程选修1需学习的实验

（微生物的利用）实验1大肠杆菌的培养和分离

（酶的应用）实验4果汁中的果胶和果胶酶实验5加酶洗衣粉的使用条件和效果实验6α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

（生物工程在食品加工中的应用）实验8果酒及果醋的制作实验实验10泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定（浅尝现代生物工程）实验11植物的组织培养实验1大肠杆菌的培养和分离第一部分:微生物的利用一、基础知识1微生物2培养基3无菌技术二、实验操作2微生物的接种技术1操作步骤微生物包括哪五类：病毒细菌和蓝细菌放线菌真菌原生动植物特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一基础知识（一）微生物

1放线菌1、结构：单细胞原核分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素

微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的

应用:2病毒的结构朊病毒（蛋白质病毒）病毒的增殖：3真菌如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构酵母菌和霉菌青霉4细菌的外形与大小细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色（革兰氏染色）后显微镜观察图1-1常见的三种细菌典型形态A.球菌

B.杆菌C.弧菌细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。细菌的构造图

细菌的结构细胞膜拟核*细胞壁成分：肽聚糖细胞壁有哪些功能？①固定细胞外形；

②保护细胞免受外力的损伤；

③阻拦大分子物质进人细胞；④使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。伤寒杆菌细胞壁中含毒素芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落细菌的菌落特征因种而异5细菌的营养物质碳源有机、无机 氮源

有机、无机水无机盐生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分为两大营养类型。自养菌:异养菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌细菌的营养类型光能自养型:光合细菌化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌（二）培养基

培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等，而液体培养基一般用于工业生产。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按化学成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型和用途液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长按物理状态来分固体培养基：菌落，菌苔按物理状态来分半固体培养基：无动力有动力(弥散)观察细菌的运动、厌氧菌的分离和菌种鉴定按物理状态来分选择培养基加入青霉素的培养基:

分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:

分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:

分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:

分离导入了目的基因的受体细胞按功能来分鉴别培养基伊红美蓝乳糖培养基按功能来分

当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;天然培养基：按化学成分来分

根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基:按化学成分来分血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分

人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。按化学成分来分3.培养基内所含的基本物质一般营养物质(1)水(2)碳源(3)氮源(4)无机盐其他物质pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。

2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方

.(2)碳源可作为碳源的物质有:含碳无机物:、、含碳有机物：蛋白质脂肪酸碳酸盐碳酸氢盐糖类（主要）葡萄糖乳糖二氧化碳不同微生物所利用的碳源不同异养型微生物的碳源为自养型微生物的碳源为含碳有机物（有机碳）含碳无机物（无机碳）(3)氮源可作为氮源的物质有:含氮无机物：、、、含氮有机物：蛋白胨牛肉膏尿素固氮微生物所利用的氮源是氮气氨气硝酸盐氨盐氮气不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方

不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐、生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、氧气、渗透压的要求．细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌配方：酵母提取物：0.5g蛋白胨：0.5gNacl：0.5g琼脂

：1g水:50ml细菌喜中性偏碱，霉菌喜中性偏酸3培养基配制原则：营养要协调目的要明确PH要适宜（三）无菌技术1.无菌技术的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作（１）消毒定义：2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

是指杀灭病原微生物的方法。区分为高程度消毒、中程度消毒、低程度消毒三种方式。

1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min如牛奶的消毒3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(2)消毒的方法：灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a

灼烧灭菌b

干热灭菌c

高压蒸汽灭菌灼烧灭菌微生物的接种工具(接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧注意适用范围干热灭菌

160－170℃；1－2h能耐高温的需要保持干燥的物品(玻璃器皿)高压蒸汽灭菌100kPa121℃15-30min通常用于培养基的灭菌

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。思考1大肠杆菌的培养和分离菌种保存培养基的配制灭菌超净工件台倒平板接种液体培养划线分离培养3.微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存二、实验操作1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基2纯化大肠杆菌3将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h和24h后，观察并记录二、实验操作

1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）大肠杆菌的培养和分离实验操作培养基的配置与灭菌取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基——细菌的扩大培养LB固体培养基——细菌的划线分离封口膜：既通气又不使菌进入2、纯化大肠杆菌接种方法有：划线分离法和涂布分离法划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术1．计算、称量2．溶化3．调pH：pH7．6

4．过滤：这一步可以省去。5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6．加塞7．包扎操作步骤8．灭菌:将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。9．倒平板:待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。倒平板技术平板划线的操作不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。1.旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2.是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养四、课题成果评价

（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。注意事项:1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养12~24h1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论

答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养平板划线的操作不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。1.旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离