第六节蛋白质的分离纯化鉴定

第六节蛋白质的分离、纯化与测定一、目的

1蛋白质结构、性质和功能研究的要求2生产实践的需要二、蛋白质分离纯化的概念从复杂的混合物中获得一种具有良好的生物学活性及化学完整性的单一蛋白质。三、蛋白质纯化的一般原则1、样品的选择：来源方便、成本低、易操作的组织或细胞。2、建立一个特异、快速、精确、可重复的检测方法。3、分级分离，先粗后细、先易后难。利用简单、易处理并快速的方法粗分，例如硫酸铵沉淀、分级离心等除去大部分杂蛋白。利用离子交换层析、分子筛层析、电泳等进一步纯化。4、避免蛋白质的变性。（pH中性、适当温度和接近生理状态的缓冲体系等）四、蛋白质分离纯化的程序（步骤）前处理（细胞破碎）抽提粗分级纯化鉴定分子的大小与形状：透析、凝胶过滤、超滤、离心溶解度：等电点沉淀法、盐析、有机溶剂抽提、分配层析法电荷：电泳、离子交换层析生物功能专一性：

亲和层析疏水性：

疏水作用层析

五、蛋白质分离纯化的依据六、具体方法(一）、生物材料的前处理分离纯化蛋白质，首先将蛋白质从原来的组织细胞中以溶解状态释放出来，并保持原来的天然状态和生物活性：

１机械破碎法：

利用机械剪切作用，将细胞研碎。如玻璃匀浆器、组织捣碎机、研钵等。

２渗透破碎法：

利用低渗使细胞溶胀破碎。例如将红细胞放入水中便发生自溶。

３交替冻融：

将生物组织冻结后，细胞内容物使细胞涨破。

４超声波法：超声振荡，使细胞膜上受张力不均匀而解体。

５酶消化：

利用蛋白酶、溶菌酶、纤维素酶等对细胞壁和膜的分解作用使他们解体。(二）、抽提

利用蛋白质溶解性，将目的蛋白溶解到适当的溶剂中。(三）、粗分级（分离）用适当方法将蛋白质从抽提液中分离，纯化的准备。特点：方法简单、处理量大除杂质，浓缩蛋白液

杂质仍较多

1根据分子大小不同的分离法：1)透析和超过滤：

利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。常用的半透膜是玻璃纸和火棉和其它合成材料。透析：将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋中放在蒸馏水中进行。透析外液可以更换，直到透析袋里无机盐等小分子物质降低到最小值为止。超过滤：利用压力和离心力，强行使其它小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上。透析：古老方法、时间长、简便超过滤：高级，较重要2)离心蛋白质分子颗粒的沉降速度取决于其分子大小例1：差速离心。交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离。适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。

方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。

例2：密度梯度离心蛋白质分子颗粒的沉降不仅取决于它的大小，而且决定于它的密度。如果蛋白质在具有密度梯度的介质中离心，质量密度大的颗粒比质量密度小的颗粒沉降的快。并且每一种蛋白质颗粒沉降，与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前。最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区段。生成的区段可在底部刺一个小孔处地方流出，分部收集，每个组份进行小样分析以已确定取代的位置。核酸分离用得多，常规用得不多。2利用溶解度差别的分离方法：影响蛋白质溶解度的外界因素有溶液的pH值、离子强度、介电常数、温度。根据蛋白质分子的结构特点适当改变外界条件，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度。

１)等电点沉淀：蛋白质分子是两性电解质，带电的基团电荷数量因为pH不同而变化。原理：当蛋白质处于等电点时，蛋白质静电荷为零，由于相邻蛋白质分子间没有静电斥力而趋于结聚而沉淀，因此它的溶解度达到最低点。特点：蛋白质保持天然活性蛋白质得率低2)盐析与盐溶①低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度，这种现象称为盐溶。盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，蛋白质及水分子的作用加强，因而溶解度提高。分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶当溶液的离子强度增加到一定数值时，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。特点：安全、简便；分辨率不高蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀。盐析（（NH4）2SO4）３)有机溶剂分级沉淀原理：①溶液介电常数降低，降低了蛋白质分子间的斥力；②同盐析相似，有机溶剂与蛋白质分子争夺水化层的水，使蛋白质聚集而沉淀。特点：分辨率高；浓度高时易变性4)利用温度对蛋白质溶解度影响在一定温度范围内，球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加。超过一定范围。大部分蛋白质变得不稳定开始变性。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质分离操作一般在0℃或更低的温度下进行。3根据电荷不同的分类方法：1)、电泳法①自由电泳：U型管内蛋白质溶液和缓冲液之间有清晰可见的界面，然后加一电场。②区带电泳：在支持物上电泳时蛋白质混合物被分成若干区带。根据支持物物理性质不同可分为4类滤纸电泳和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。

常用滤纸和凝胶电泳。③聚丙烯酰胺电泳（盘状电泳）：以聚丙烯酰胺为支持物，制成凝胶柱，凝胶柱由两节凝胶组成（小节浓缩胶、大节分离胶）这二段胶的孔径大小、缓冲液组分、离子强度、pH值、电场强度都是不同的。。电泳时，样品被压缩成一个薄层，然后进行电泳。电泳过程有三个效应：样品浓缩效应、凝胶对分离分子筛分效应、电泳分离的电荷效应。使样品分离效果好，分辨率高。4吸附法：蛋白质分子通过次级键的相互作用能吸附在某些吸附剂上，由于不同分子的吸附能力不同，可以通过洗脱使他们逐步解脱下来。某些物质，例如极性的硅胶、氧化铝以及非极性的活性碳粉末具有吸附能力。适合于大规模提取的第一步。(四)纯化进一步除去杂质,获得单一蛋白质样品1、离子交换层析（1）基本原理利用被分离物质的电荷与层析载体电荷的相互作用达到分离纯化。层析载体的种类：阳离子交换剂（带负电）磺酸基（强酸型）SP-Sephadex-O-(CH2)3-SO3H羧甲基（弱酸型）CM-52-O-CH2COOH

阴离子交换剂（带正电）二乙基氨基乙基（中强碱型）DEAECH2-CH2-N(C2H5)2季氨盐（强碱型）N+(CH3)3基架